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目的肠易激综合征(IBS)是一种以腹部不适伴排便习惯改变为特征的功能性肠病。近年来,随着人们生活节奏的加快、饮食结构的改变,神经、精神、感染因素所致的肠易激综合征发病率有上升趋势,对患者的生活质量和工作造成了很大的困扰。本实验目的是以新生期结肠炎大鼠(NCI)为动物模型,研究Toll样受体4与NF-?B调控内源性硫化氢合成酶胱硫醚β合成酶(CBS)表达的上调,以及在新生期结肠炎性刺激诱导的慢性内脏痛觉中的作用。方法1.以出生10天的雄性SD大鼠为对象,肛门处插入2cm,结肠内注射0.2ml的0.5%稀乙酸来建立内脏痛觉高敏的模型,注射等容量的生理盐水作为对照。待大鼠成年(6周)后,运用腹壁撤回评分(AWR score)方法评测NCI大鼠的痛行为反应。2.运用Western blotting方法分析对照组和实验组大鼠背根神经节(DRG,T13-L2)的Toll样受体4,NF-?B,CBS蛋白表达量。3.结肠管壁注射荧光素(Dil)来逆行标记结肠特异性背根节(DRG)神经元,运用全细胞膜片钳方法检测DRG神经元的兴奋性。4.运用免疫荧光的方法研究Toll样受体4是否与NF-?B、CBS在结肠相关DRG(T13-L2)神经元上共表达。5.运用染色质免疫共沉淀技术进一步验证在NCI大鼠的DRG中NF-?B与CBS的启动子区特异性结合情况。结果1.NCI增加肠相关DRG神经元(T13-L2)Toll样受体4的表达。2.行为学实验发现,鞘内注射Toll样受体4的拮抗剂CLI-095,能够显著降低NCI大鼠的内脏痛觉高敏。3.运用电生理膜片钳技术对肠特异性DRG神经元细胞进行研究后发现,Toll样受体4的拮抗剂CLI-095能显著降低肠相关DRG神经元的兴奋性。4.为了进一步研究Toll样受体4的作用机制,我们采用免疫荧光的方法发现Toll样受体4与CBS在Dil标记的肠相关DRG神经元上共表达,并且Toll样受体4的拮抗剂CLI-095能够翻转NCI大鼠结肠相关DRG的CBS的表达。5.免疫荧光结果发现,Toll样受体4与NF-κB在Dil标记的肠相关DRG神经元上也有共表达,另外,western blotting结果显示NCI能够增加细胞核NF-κB,并且Toll样受体4的拮抗剂CLI-095能够翻转这一增加。6.腹腔注射NF-κB的拮抗剂PDTC,能够减少CBS的表达,并且可以降低NCI导致的内脏痛觉超敏。7.与对照组相比,染色质免疫共沉淀结果显示CBS与NF-κB的DNA结合位点在NCI大鼠肠相关DRG中的特异性结合显著增强。8.为了进一步确认Toll样受体4的作用机制,我们运用细胞培养的方法,体外孵育Toll样受体4的激动剂脂多糖(LPS),发现LPS可以显著增加NF-κB和CBS的表达,并且孵育NF-κB的拮抗剂PDTC可以翻转CBS的增加,但是孵育CBS的拮抗剂AOAA并不能翻转NF-κB的增加。结论我们的结果提示CBS的表达上调可能是由TLR4/NF-κB信号通路的激活来介导的,TLR4在IBS慢性内脏痛觉高敏的形成中发挥作用。因此,本实验研究在一定程度上揭示了功能性胃肠疾病如IBS病人慢性内脏痛产生的分子机制,从而可能为慢性内脏痛的治疗提供更有效的治疗靶点。