研究背景:膝关节软骨病变是影响几乎所有年龄段的人的疾病,严重影响着全人类生活质量。导致骨软骨损伤的病因很多,例如创伤、疾病或老化等。在解剖结构上,关节软骨和硬骨两者紧密相连,生物学功能上也相互影响。骨软骨界面是介于透明软骨与软骨下骨之间的连接面。天然的连接面是由软骨钙化区构成,其结构薄而致密,起着隔离软骨层和软骨下骨层的作用,同时又将二者有机地整合在一起。骨软骨缺损同时累及软骨层和软骨下骨层时,两者不同的力学性能和组织结构凸显了钙化界面的重要性,在维护软骨和软骨下骨的正常功能上,骨软骨界面的存在是必需的。因此,理想的复合骨软骨支架应模拟正常骨软骨组织结构,所以在制备复合支架时应当构建出钙化层的结构,进而更好地促进骨软骨组织缺损的修复。骨软骨一体化支架再生将成为科研和临床的热点议题。因此,本研究主要包括以下内容:1软骨层支架工艺构建,筛选出适合软骨细胞表型与功能的水凝胶支架;2开发具有钙化层的一体化支架;3体外评估一体化支架的特征及钙化界面层的屏蔽作用。方法:在本研究中,我们选取具有良好的生物相容性的海藻酸钠和壳聚糖水凝胶用于构建具有钙化层的一体化复合支架。首先进行软骨支架工艺的优化,筛选两种分子量接近但古罗糖醛酸(G)含量不同的海藻酸钠材料,分布标记为HG和MG,制备出具有不同力学性能的海藻酸钠-胶原复合水凝胶支架,重点考察海藻酸钠中G含量对软骨细胞表型与功能的影响规律。以原代新西兰大白兔关节软骨细胞为研究模型,在扫描电镜下观察软骨细胞在材料上的粘附力和生存能力。然后将通过Cell Counting Kit-8(CCK-8)实验和活/死细胞染色实验测定两组材料与软骨细胞共培养观察细胞增殖活性,细胞骨架形态染色实验测定软骨细胞在两组水凝胶上的细胞形态变化。实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)实验和分别测定两组材料与软骨细胞共培养7,14,天后的软骨细胞活性,软骨基因AGG,SOX9和Collagen-II(Col-II)mRNA的表达情况。通过ELISA实验检测软骨细胞胞外基质Col-II和糖胺聚糖(GAGs)的表达情况。进一步构建钙化层支架,通过离子交联的方式将骨软骨复合支架的软骨层支架和软骨下骨支架整合起来。通过扫描电镜和micro-CT进行支架结构表征。用不同颜色荧光标记不同层次的一体化支架,在共聚焦显微镜下观察支架中高分子材料的分布情况。最终对一体化支架中钙化层是否具有良好的细胞屏蔽作用进行体外验证。通过tanswell细胞共培养实验验证钙化层存在的必要性。进一步将软骨细胞,内皮细胞和成骨细胞分别用荧光探针标记,将其分别播种在软骨层和软骨下骨层,共培养七天后,共聚焦显微镜下观察钙化层支架细胞屏蔽效果。结果:SEM观察,在MG组中软骨细胞在支架表面的孔隙壁上有良好的粘附和扩散;细胞骨架形态染色实验结果显示7天的共培养后,在MG组中软骨细胞更好的保持着细胞原有的形态。细胞活7死染色显示7天后,软骨细胞在MG组中生长状况的较HG组更好。另外,通过CCK8实验发现软骨细胞在两组水凝胶支架表面均保持良好的增殖能力。qRT-PCR的结果显示MG组水凝胶上维持软骨功能的相关基因SOX9、Agg和COLII的表达都显著上调(P<0.05)。ELISA实验结果显示软骨细胞胞外基活/死细胞染色实验质(COLII和GAGs)在MG组水凝胶的表达量显著高于HG组水凝胶(P<0.05)。结论:我们选择了MG组海藻酸钠与胶原制备的互穿网络水凝胶作为软骨组织工程支架的软骨层,HG组海藻酸钠与胶原和纳米羟基磷灰石制备的互穿网络水凝胶作为软骨组织工程支架的软骨下骨层。并通过带有正电荷的壳聚糖与荷负电的海藻酸钠反应,在两层之间通过静电自组装形成聚电解质络合膜形成一体化支架,进一步验证了具有致密的聚电解质络合膜作为钙化界面层的一体化支架起到了细胞屏蔽效应,实现了两种微环境的隔离。