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目的:本研究采用人胰腺癌细胞系SW1990为靶细胞,观察氧化苦参碱(Oxymatrine,OM)对细胞增殖、体外侵袭和转移能力的影响,检测氧化苦参碱作用细胞前后VEGF、MMP-2基因表达的改变和VEGF蛋白的变化,初步探讨氧化苦参碱抑制细胞侵袭和转移的作用机制,为临床氧化苦参碱治疗胰腺癌提供理论和实验根据。
方法:(1)MTT比色法检测氧化苦参碱对细胞增殖活性的影响。(2)通过光学显微镜观察氧化苦参碱作用于细胞后,细胞形态的改变。(3)通过细胞过河实验、细胞粘附实验、趋化实验、细胞侵袭实验检测氧化苦参碱对SW细胞运动、粘附及侵袭能力的影响。(4)采用半定量RT-PCR法检测氧化苦参碱作用于SW1990细胞后对侵袭转移相关基因VEGF、MMP-2基因表达的影响。(5)用酶联免疫分析法(ELISA)检测氧化苦参碱作用SW细胞后VEGF蛋白表达的变化。
结果:
(1)MTT比色法检测结果显示氧化苦参碱可抑制胰腺癌SW1990细胞增殖,并且氧化苦参碱对胰腺癌SW1990细胞的增殖抑制作用呈浓度-时间依赖性。低浓度氧化苦参碱(1mg/mL)对SW1990细胞增殖起到一定的抑制作用,高浓度氧化苦参碱(16mg/mL)对细胞有剧烈抑制作用,当作用72小时后抑制率高达82.9%。其中1mg/mL、2mg/mL和4mg/mL氧化苦参碱组抑制率与对照组比较差异无显著性(P>0.05)。
(2)细胞形态学改变:对照组细胞则贴壁生长,几乎无脱落,光镜下见细胞多边形,胞质饱满,透光性好,相邻细胞生长融合成片,鹅卵石样排列,边界清楚。各处理组细胞经苦参碱分别处理24h后,肉眼均可见有细胞由贴壁脱落,悬浮在培养液中。光镜下见细胞变圆,体积缩小,细胞质内可见较多颗粒,颜色加深,呈深褐色,核颜色也加深,折光性增强。随着氧化苦参碱浓度的增加和作用时间的延长,相应的细胞变化程度也随
(3)运动和侵袭相关实验结果:
①细胞过河实验结果:对照组过河时间为(34.50±4.12)h,1mg/mL、2mg/mL和4mg/mL氧化苦参碱组过河时间分别为(48.80±3.56)h、(65.46±4.25)h和(70.54±3.53)h,其中4mg/mL氧化苦参碱组过河时间较对照组明显延长,氧化苦参碱组过河时间与对照组比较差异均有显著性(P<0.05);
②经氧化苦参碱处理24h后,胰腺癌细胞的黏附力、运动能力和侵袭力下降,且随着氧化苦参碱浓度的增加而下降。其中4mg/mL氧化苦参碱组干预24 h后,黏附抑制率、侵袭抑制率和趋化运动抑制率分别为(46.83±7.3)%、(43.4±3.7)%、(46.3±3.3)%,与对照组比较差异均有显著性(P<0.01);
(4)RT-PCR法检测氧化苦参碱对SW1990细胞侵袭和转移相关基因VEGF、MMP-2基因表达的影响:MMP-2 mRNA和VEGF mRNA在胰腺癌SW1990细胞中表达。氧化苦参碱处理SW1990细胞24h后,随着浓度增加,MMP-2 mRNA和VEGF mRNA的表达逐渐减弱,呈浓度依赖关系。氧化苦参碱组基因表达与对照组相比差别均有显著性(P<0.05)。
(5)酶联免疫分析法(ELISA)检测结果:对照组VEGF含量为(441.06±16.70)Pg/mL,1mg/mL、2mg/mL和4mg/mL氧化苦参碱组VEGF含量分别为(356.09±16.52)、(265.50±5.45)和(158.11±17.69)pg/mL,氧化苦参碱组VEGF含量与对照组比较差异均有显著性(P<0.05);
结论:
(1)氧化苦参碱在体外可以抑制胰腺癌SW1990细胞的增殖,抑制作用呈现浓度-时间依赖性。
(2)氧化苦参碱在体外可以抑制胰腺癌SW1990细胞的粘附、趋化运动和侵袭。
(3)氧化苦参碱可下调胰腺癌SW1990细胞MMP-2和VEGF基因的表达,减少细胞VEGF蛋白的产生。
(4)氧化苦参碱抑制胰腺癌SW1990细胞侵袭和转移,机制可能是通过下调MMP-2、VEGF基因的表达和下调VEGF蛋白实现的,具体机制尚待讲一步研究。