论文部分内容阅读
疫苗的使用在马立克氏病(MD)的预防和控制中起到重要作用。但随着马立克氏病毒(MDV)毒力不断的进化,现有疫苗已不能提供较好的保护。鸡白细胞介素2(ChIL-2)是具有广泛生物活性的细胞因子,作为免疫增强剂在疫苗的研制中得到广泛研究。本研究利用MDV血清Ⅰ型毒株CVI988/Rispens为载体,构建表达ChIL-2基因的重组病毒(rMDV-IL2),评价其免疫保护效力及免疫增强作用,为MD及其他疾病的防制提供疫苗储备。将ChIL-2基因定向克隆至pEASY-M1表达载体中,通过PCR方法扩增出ChIL-2基因的表达盒,并与实验室先前构建的含有CVI988/Rispens基因组同源臂的pU/D载体相连,构建转移载体pU/IL2/D。将pU/IL2/D与含有GFP报告基因的CVI988/Rispens基因组共转染CEF细胞,通过筛选、纯化获得重组病毒rMDV-IL2。PCR、Western-Blot和MTT试验及复制特性检测结果显示,ChIL-2基因正确插入到MDV基因组中并能成功表达具有生物活性的ChIL-2,且对病毒在体外的复制特性无显著影响。对1日龄雏鸡分别免疫rMDV-IL2和CVI988/Rispens后的免疫器官指数进行测定,结果显示rMDV-IL2组的免疫器官指数均高于CVI988/Rispens组,免疫后21d和28d胸腺指数存在显著性差异；免疫后21d、28d和35d脾脏指数和法氏囊指数均存在显著性差异。在外周血T淋巴细胞亚群检测试验中,rMDV-IL2组与CVI988/Rispens组的CD4+T淋巴细胞变化规律类似,但前者要高于后者,其中21d和28d存在显著性差异；rMDV-IL2组CD8+T淋巴细胞在免疫后第7d就显著高于CVI988/Rispens组,第28d达到最高值并维持在较高水平。这表明rMDV-IL2能促进免疫系统发育和成熟,提高细胞免疫应答水平。在对rMDV-IL2的免疫保护效力测定试验中,对1日龄雏鸡分别免疫rMDV-IL2和CVI988/Rispens,7日龄用1000PFU的MDVRB1B株进行攻毒,连续观察90天。通过体重称量、淋巴细胞转化水平检测、免疫器官指数测定以及保护指数计算等方法来评价rMDV-IL2的免疫保护效果。结果显示, rMDV-IL2能有效地控制强毒攻击后引起的体重下降,且淋巴细胞转化水平显著高于CVI988/Rispens组。免疫器官指数测定结果显示,rMDV-IL2组高于GVI988/Rispens组。胸腺指数在攻毒后28d差异显著(p<0.05)；脾脏指数和法氏囊指数在攻毒后21d、28d和35d差异显著(p<0.05)。rMDV-IL2组的PI为81.6%, CVI988/Rispens组的PI为78.9%。为了验证rMDV-IL2表达的ChIL-2对其他疫苗是否具有免疫增强作用,将rMDV-H2和CVI988/Rispens分别免疫1日龄雏鸡,10日龄免疫新城疫La Sota疫苗,每周进行NDV抗体检测,持续三周。NDV抗体的HI试验和ELISA检测结果显示,rMDV-IL2组在免疫后一周,抗体滴度大于4log2,免疫后3周内抗体水平持续升高,且抗体滴度在前两周内显著高于CVI988/Rispens组和对照组。这说明rMDV-IL2能促进新城疫La Sota疫苗免疫后抗体的生成,具有免疫增强作用。