背景和目的常染色体显性遗传多囊肾病(Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease,ADPKD)是一种医学上较为容易遇到的、具有致命风险的常染色体单基因遗传疾病。ADPKD患者通常是在中青年时确诊,全世界大概有1/1000—1/400的人患有此病,1200多万人达到放射诊断标准而诊断为此病。相关研究表明,ADPKD通常由PKD1和PKD2两种基因突变导致,PKD1位于16号常染色体短臂一区3带3亚带,PKD2位于4q21区。PKD1通过转录翻译得到的产物为多囊蛋白1(polycystin-1,PC1),PKD2通过转录翻译得到的产物多囊蛋白2(polycystin-2,PC2)。多囊蛋白1是一种血浆膜样受体蛋白,主要分布在细胞膜上,维持细胞之间或是细胞与细胞外液之间的相互作用;多囊蛋白2是一种非选择性的阳离子通道,PC2与PC1结合后,形成复合物,该复合物对钙离子有较强的通透性,对钙离子起到门控通道的作用。位于6号染色体短臂一区2带的PKHD1基因发生突变则会导致隐性遗传多囊肾病的形成,PKHD1通过转录翻译得到的产物FPC蛋白。对已发现的多囊肾病基因的致病位点的研究发现,大片段缺失、重复或重排突变发现极少(约为3%—4%),ADPKD主要以点突变为主。因此,对患者的致病基因序列进行直接测序仍然是对多囊肾病的基因诊断的主要技术。ADPKD是一种明确的基因座异质性疾病,它的基因诊断相当复杂,PKD1或PKD2两个基因有一个出现致病突变即可引发ADPKD,其中多囊肾疾病多是由PKD1基因突变引起的,约为85%,临床表型也最为严重,导致病人发展至终末期肾病的时间比PKD2要早20年。其次,从目前已有的研究来看,ADPKD基因突变并没有像其它疾病一样有固定的位点,它的突变可能会发生在PKD1和PKD2基因的任何一个位点,较难检测。ADPKD的特点是双肾多发囊肿和早发性慢性肾功能衰竭,最终将导致终末期肾病(ESRD),只能进行肾替代治疗或肾移植维持生命。除肾脏囊肿外,ADPKD通常还伴有肝囊肿、脾囊肿、胰囊肿、卵巢囊肿和精囊囊肿等肾外表现,它也是颅内动脉瘤发生发展的重要危险因素;多囊肾患者患动脉瘤的概率为4%至41%。由于ADPKD有向家族聚集的倾向,而且该病一般发病较晚,多于成年引发,十分不利于患者自身的治疗,大多患者在结婚生子以后才被确诊为多囊肾病,生出携带有致病突变的孩子概率很大,这对患者及其家属和保健系统也造成了沉重的负担。颅内动脉瘤(intracrartial aneurysm,IA)系颅内动脉血管壁发生病理性局限性扩张形成的血管瘤样病变,一般多会引发自发性蛛网膜下腔出血。颅内动脉瘤一旦发生破裂,具有极高的致死性和致残性,而且目前并没有具体的药物来稳定或预防其破裂,所以它是给患者生命和健康带来很大威胁的一种疾病,也给家庭和社会也带来了繁重的负担。IA的发病机制尚未清楚,通常认为它的发病是由多种因素共同引起的。目前研究已经证实年龄、性别、抽烟、酗酒、高血压、吸毒、季节、家族史是颅内动脉瘤的高危因素,也很可能是血流动力改变化及后天退行性变等综合作用的结果。然则相关研究报道,遗传因素对于引发IA也起到了十分重要的作用。心血管并发症是ADPKD的首要死因,而IA引起的蛛网膜下腔出血是其中最重要的并发症。ADPKD中IA的诊断和治疗策略还没有被全面建立起来。IA是所有ADPKD患者心血管并发症中最严重的一种,这是因为血管瘤的破裂后随之而来的是50%的高死亡率。尽管多囊蛋白在动脉平滑肌的表达,这一PKD基因突变诱发动脉瘤的形成机制仍然不完全清楚,PKD1和PKD2的突变对于IAs的发病风险相等。靠近PKD1 5’端一半距离的位点的突变更容易发展成为IAs。数学建模表明,多流体填充肾间质囊肿的形成起始于儿童期,从而导致早期颅内动脉瘤较难检测。因此我们希望建立一个高效特异的检测突变的体系,研究ADPKD伴发IA的患者PKD1突变与一般ADPKD患者突变的区别,找出基因层面上辅助诊断的方法,使ADPKD和IA在形成和潜伏期就可以被检测出,以便及早治疗,从而减免患者的痛苦。方法在上海交通大学附属第六人民医院收集并整理从2013年7月到2014年8月在该院接受治疗的ADPKD患者,所有患者均经B超、CT、磁共振血管成像法筛选伴有颅内动脉瘤的患者,共收集ADPKD伴发ICA患者23例。用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管采取23例患者术前早晨空腹外周血4mL,置于冰箱中,试剂盒提取23例患者的基因组DNA。设计巢式PCR反应,分析所需的特异性引物,选择六对长片段引物,分别扩增PKD1的1号外显子、2到12号外显子、13到15D号外显子、外显子15E到22、外显子22到32、36到46号外显子,选择特异性好的PCR反应条件进行扩增。把扩增所得小片段产物进行一代测序,对结果进行分析。结果1所得PCR产物经电泳验证,条带高亮且产物唯一,特异性较好。2 23例样本进行测序后共检出突变85个。这些突变均为点突变,其中47个错义突变,35个同义突变,1个无义突变,1个移码突变。而且所有样品均在7号外显子检测到同一突变。3共发现未知突变占19种,其中错义突变14种,同义突变3种,无义突变1种,移码突变1种。结论1 PKD1 7号外显子检测到的同一突变,与普通PKD患者和正常人均不同,为多囊肾伴发动脉瘤的研究提供了指引。2 PKD1靠近5’端一半距离共发现72个突变,占发现突变总数的84.70%,证明靠近PKD1 5’端一半距离的位点的突变更容易发展成为颅内动脉瘤。