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目的:通过构建CRISPR/Cas9慢病毒载体,转染HSC-T6细胞,获得能稳定表达Cas9蛋白的HSC-T6细胞和COX-2基因缺陷的HSC-T6-COX-2-/-细胞,为后期的功能研究提供良好的工具和手段,为临床上治疗肝纤维化提供新策略。方法:(1)设计合成COX-2基因特异性的sg RNA(COX-2-sg RNA-1、COX-2-sg RNA-2、COX-2-sg RNA-3),并将其连接至GV371载体上,提取重组后的质粒,将其与包装质粒共同转染到293T细胞,形成慢病毒颗粒,荧光法检测病毒滴度。(2)按照MOI值计算病毒最适用量,先将Lenti-Cas9-puro转染至HSC-T6细胞,嘌呤霉素筛选得到HSC-T6-Cas9细胞,再用Lenti-COX-2-sg RNA-EGFP转染至HSC-T6-Cas9细胞获得HSC-T6-COX-2-/-细胞,通过Cruiser酶切检测及Western blot等方法在基因和蛋白水平上进行敲除验证。结果:(1)测序验证COX-2-sg RNA表达载体构建成功。(2)重组表达质粒和包装质粒共同转染到293T细胞,形成慢病毒颗粒,荧光法检测病毒滴度均在1E+8以上。(3)成功构建能稳定传代的Cas9蛋白的HSC-T6细胞和COX-2基因缺陷的HSC-T6-COX-2-/-细胞细胞模型,通过Cruiser酶切检测及Western blot试验,结果提示CRISPR/Cas9慢病毒表达载体能在靶点起作用,其中COX-2-sg RNA-2敲除作用最明显,并且COX-2蛋白表达水平较CON组和NC组相比显著下降,提示COX-2-sg RNA有活性,且差异有统计学意义(P<0.05)。结论:(1)成功构建了针对COX-2靶基因的CRISPR/Cas9慢病毒载体;(2)Lenti-Cas9-puro和Lenti-COX-2-sg RNA-EGFP慢病毒载体成功转染HSC-T6细胞,获得稳定表达Cas9蛋白的HSC-T6-Cas9细胞和COX-2基因敲除的HSC-T6-COX-2-/-细胞,为后期对COX-2基因敲除后HSC-T6细胞的功能及其作用机制的研究提供了实验基础。