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研究背景和目的:
肝细胞性肝癌(简称肝癌,HCC)是我国最常见的高发肿瘤之一,其发生发展是由体内多基因参与、多步骤协同的复杂过程。目前,尽管已经鉴定了一些肝癌相关的抑癌基因,如p53和p16INK4a,并明确了它们在肝癌中的特异性失活,但是在肝癌发生中特异性激活的癌基因却少见报道。癌基因p28GANK在肝癌中特异性高表达,编码的蛋白是人26S蛋白酶体(26S proteasome)调节亚单位19S/PA700复合物的一种非ATP酶亚基,其核酸序列中含有6个串联排列的ANK重复单位,其保守的ankyrin序列介导蛋白与蛋白间的相互作用。早期实验结果表明在肝癌细胞中利用腺病毒介导的siRNA(Adsip28GANK)下调p280GANK的表达可明显抑制肿瘤细胞的生长,并可在体内体外诱发肿瘤细胞凋亡。实验小组前期实验表明癌蛋白p28GANK抑制NF-κB的转录活性并促使NF-kB的出核,但其作用机制还不是十分明确。
NF-κB在调节免疫、炎症反应,粘附分子表达,生长控制以及细胞凋亡过程中发挥着重要作用,它能被多种因素激活,包括细胞因子TNF-α、IL-1β、细菌脂多糖(LPS)、T细胞白血病病毒表达的Tax蛋白、佛波脂及紫外线等等。随着对NF-κB激活调控机制研究的深入,以往认为IκB蛋白磷酸化后的解离和降解就足以激活NF-κB的转录,现在越来越多的研究显示NF-κB复合体RelA/p65亚基的核内磷酸化及乙酰化状态在调节NF-κB复合体入核及转录活性方面起着重要作用,它们决定着NF-κB转录应答强弱和持久性。NF-κB可与组蛋白酰基转移酶(HATs,例如CBP/p300)相互作用,正向调控基因表达；RelA和p50还可与HDACs相互作用,负向调控基因转录,因此酰基化在NF-κB的转录调控方面充当分子开关的作用。近来有研究表明组蛋白去乙酰化酶HDAC3可以使NF-κB发生去乙酰化作用,从而与IκBα结合形成复合体,促使其出核,形成非活化状态的NF-κB二聚体。p28GANK是否通过影响了NF-κB的乙酰化加速其出核?发现癌蛋白p28GANK可以抑制NF-κB/RelA的乙酰化,p28GANK直接结合HDAC3协同但不依赖于HDAC3负调控NF--κB/RelA的乙酰化,从而加速NF-kB出核。实验研究表明NF-κB的磷酸化状态在一定程度上决定NF-kB的乙酰化水平,推测p28GANK对NF-κB/RelA的乙酰化是通过对其磷酸化水平的调控而完成的。实验发现p28GANK通过抑制其RelA 276磷酸化位点,进而影响乙酰化酶p300与p65的结合,从而影响RelA的乙酰化水平。还检测了p28对NF-kB下游部分靶基因的调控作用,探讨p28调控NF-kB的生物学功能。本实验是对NF-kB通路调控机制的新发现和补充,亦有助于进一步阐明肝细胞癌发生发展过程中精细分子机制。
实验方法：
1.构建p28GANK和HDAC3-GST融合质粒,构建含有Myc标签的p28GANK全长及各种突变体融合质粒,含有Flag标签的RelA全长及各种突变体融合质粒；
2.细胞免疫荧光技术检测293A细胞共转p28GANK和NF-kB(RelA/P65)后,NF-kBRelA/P65在细胞内定位的变化；
3.运用Western blot技术,检测293T细胞转染p28GANK后,NF-kB的RelA/p65的乙酰化水平；肿瘤细胞系经腺病毒介导的RNAi p28GANK 36-48h后,反向观察下调p28GANK对NF-kB乙酰化水平的影响；
4.使用双荧光素报告基因系统检测外转p28GANK和HDAC3是否协同对NF-kB转录活性的影响；
5.用免疫共沉淀(IP)的方法观察p28GANK和去酰基转移酶HDAC3是否存在直接相互作用；
6.运用细胞免疫荧光技术检测运用Western blot及核浆分离技术,检测293T细胞瞬转p28GANK和HDAC3以及在去酰基转移酶抑制剂TSA作用下,NF-kB的RelA/P65亚基在胞核胞浆中的分布变化；
7.运用Western blot技术,检测293T细胞瞬转p28GANK后,NF-kB的RelA/P65 276位点的磷酸化水平,运用免疫共沉淀(IP)检测其RelA/P65与p300结合水平；
8.运用GST-pull down,检测p28GANK和酰基转移酶p300/CBP是否存在竞争结合RelA/P65;
9.运用RT-PCR技术,检测在转录水平上p28GANK对酰基转移酶p300/CBP是否具有调控作用；运用染色质免疫共沉淀技术,检测293T细胞瞬转p28GANK后,NF-kB下游靶基因的变化；
10.在Hep3B细胞中,用腺病毒介导的RNAip28GANK反向观察下调p28GANK对NF-kB下游靶基因的变化；
结果：
1.发现293T细胞中过表达p28GANK促使NF-kB的出核。
2.293T细胞中过表达p28GANK,可抑制NF-kB/RelA的乙酰化水平；随着p28GANK剂量的增加,其NF-kB/RelA的乙酰化水平逐渐减弱；在3T3稳定表达的p28GANK细胞中,其内源性的NF-kB/RelA的乙酰化水平也是下调的。
3.HepG2,SMMC-7721细胞系中,经腺病毒介导的RNAi干扰p28GANK 36-48hr后,NF-kB/RelA的乙酰化水平升高。
4.免疫共沉淀(IP)显示p28GANK与组蛋白去酰基转移酶HDAC3直接相互作用。
5.报告基因荧光素酶显示p28GANK可协同组蛋白去酰基转移酶HDAC3共同调控其转录活性；Western blot显示293T细胞中,p28GANK可协同组蛋白去乙酰化酶HDAC3负调控NF-kB/RelA的乙酰化水平；在去酰基转移酶抑制剂TSA的作用下,p28GANK仍可使NF-kB/RelA去乙酰化。
6.Western blot技术和细胞免疫荧光分析表明293T细胞外转p28GANK和去酰基化转移酶HDAC3可使NF-kB/RelA出核；Western blot技术分析表明,p28GANK抑制NF-kB/RelA的276磷酸化位点,促使NF-kB/RelA与乙酰化酶P300/CBP结合水平减弱,因而抑制其NF-kB/RelA的乙酰化水平。
7.GST-pull down实验证明p28GANK与P300/CBP并不竞争结合RelA8.染色质免疫共沉淀实验(CHIP)实验证明,p28GANK影响NF-kB下游靶基因的表达。
结论：肝癌癌蛋白p28GANK可与NF-kB的亚基RelA直接结合并通过促使其出核,p28GANK抑制NF-kB/RelA的乙酰化,并与去酰基转移酶HDAC3直接结合并作用于NF-kB/RelA。研究结果表明p28GANK可协同HDAC3负调控NF-kB/RelA的乙酰化；下调肝癌细胞中p28GANK的表达,则NF-kB/RelA的乙酰化水平增强。细胞免疫荧光实验证明在TNF及TSA刺激下,p28GANK仍可使NF-kB/RelA去乙酰化。核质分离western blot表明p28GANK与HDAC3抑制NF-kB/RelA在核内的分布。进一步研究其机制,发现p28GANK与酰基转移酶P300/CBP并不竞争结合RelA/p65。而是p28GANK通过抑制其RelA 276磷酸化位点,进而影响p65结合p300乙酰化酶水平,从而影响RelA的乙酰化水平。实验表明p28GANK这是对NF-kB通路调控机制的新发现和补充,亦有助于进一步阐明肝细胞癌发生发展过程中精细分子机制。