胚胎干细胞(embryonicstemcell，ESC)具有无限自我更新和多向分化潜能。研究其自我更新与分化的分子调控机制对于大量制备干细胞，高效诱导特定组织细胞的定向分化以用于疾病的治疗，以及了解胚胎发育的分子机制、肿瘤的发生机制等均有重要的意义。然而目前对其相关的信号传递通路却并不完全了解，因此，系统地筛选并找出其调控分子对进一步了解干细胞维持自我更新和发生分化的机理非常必要。 小鼠基因敲除技术是基因功能研究最重要的技术之一，但该技术存在技术复杂、周期长、费用昂贵等缺点，极大地限制了它的应用，而且该技术不能用于大规模功能基因的筛选。虽然基因芯片、基因和蛋白差异表达分析等技术符合大规模、高通量的要求，但它们只能确定基因表达的差异，不能直接进行基因功能的筛选，往往需要用其它技术来确定基因的功能。建立大规模、高通量基因功能直接筛选的新技术平台对强化我国科技的原始创新能力，发现具有重要功能的新基因及其应用具有非常重要的意义。 RNAi文库是一种简单、高效、大规模和高通量的功能基因组学研究工具。在线虫等模式生物的研究中，利用该技术建立随机的功能缺陷文库，经过系统的表型筛选以鉴定缺陷基因的功能，很快即在其胚胎发育等诸多领域获得了重要的发现，而可用于哺乳动物细胞的RNAi文库直到2003年才见报道。目前应用哺乳动物细胞RNAi文库，已在包括肿瘤抑制基因、信号转导通路调控分子、非编码RNA等功能筛选中获得了一些重要的新发现，证明RNAi文库在研究基因功能、发现新的药物靶基因、发现疾病相关基因、探索肿瘤治疗新途径等众多领域有广阔的应用前景。 目前已报道的哺乳动物细胞RNAi文库建库方案有两类，分别是哺乳动物细胞已知基因RNAj文库和随机RNAi文库。已知基因RNAj文库需要知道靶基因的序列，分别构建成千上万的siRNA表达载体工作量巨大，费用非常昂贵，在我国目前的条件下应用难度大。基于siRNA的哺乳动物细胞随机RNAi文库不需知道靶基因的序列，从理论上讲可以构成抑制任何基因表达的干扰文库，但该文库构建步骤多，技术复杂，获得高质量文库难度大。通过随机合成DNA片段构建的RNAi文库不以细胞DNA为基础，根据我们的计算分析，大量的siRNA没有任何靶基因。以上短片段siRNA表达文库的另一共同缺陷是，不同siRNA对基因表达的抑制效果存在非常大的差异，文库的质量难以保证。 鉴于此，本研究首先建立了通过PCR引入靶特异性序列，再经一次克隆构建U6和H1双启动子RNAi载体的技术方法，构建的双启动子载体中，U6和H1相对排列，均以其间插入的靶序列为模板，分别转录出其正义和反义链，形成功能性siRNA。利用该方法可特异性抑制外源及内源性功能基因的表达，使大规模制备siRNA表达载体更为简便、有效，并可用于建立随机RNAi文库。 遵循该思路，本研究自行设计并建立了转录长dsRNA的H1/U6双启动子载体系统，通过将ES细胞基因组cDNA的Sau3AI酶切片段插入双启动子之间的BamHI位点，成功构建了针对鼠ES细胞的RNAi文库。实验证明，该载体系统能有效介导干扰外源基因egfp及内源基因MTM1在ES细胞中的表达。与现有的RNAi文库相比，本研究建立的cDNA干扰文库在以下几个方面具有优势：1.方法简单，所需费用、周期和操作难度都大大降低；2.更能保证干扰效果，长dsRNA在细胞内被Dicer切割后，相当于针对同一基因不同位点产生多个功能性siRNA，不受传统方法选择原则的局限；3.文库的完整性和代表性都更易于保证。 由于ES细胞在自我更新和诱导分化状态下细胞集落形态明显不同，本研究将cDNA干扰文库导入小鼠胚胎干细胞CCE，利用促分化培养模式，以细胞集落形态这一表型变化作为判断指标，筛选干扰其表达后有利于抑制ES细胞发生分化的功能基因，即ES细胞自我更新的负调控分子。筛库的结果发现两个可疑分子：Rai17和Ubiquitin。对Ubiquitin进一步功能鉴定的结果显示，该分子具有调控ES细胞自我更新与分化的功能，其表达量的变化是决定ES细胞状态和命运的重要因素；通过RNAi抑制该分子的表达有利于ES细胞保持自我更新状态、阻止分化的发生并提高其增殖能力。 综上所述，本研究首先建立了简便易行、通过PCR引入靶序列构建双启动子siRNA表达载体的方法；其次，提出并建立了利用双启动子载体和cDNA构建新型RNAi文库的策略和技术路线，为系统功能基因组学研究提供了新的技术平台；通过筛选cDNA干扰文库及功能鉴定，发现抑制ubiquitin的表达有利于ES细胞保持自我更新状态，为了解ES细胞自我更新与分化的相关调控机制以及ubiquitin的功能提供了新的切入点。