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花鳗鲡(Anguilla marmorata)是我国珍贵的经济鱼,具有较高的经济价值,营养丰富,资源匮乏,是国家Ⅱ级野生保护动物。当前花鳗鲡的养殖苗种完全依赖于捕捞天然苗种,不仅会严重影响花鳗养殖业的健康持续发展,而且对花鳗鲡自然资源的保护与合理利用也会造成极大威胁。鳗鲡人工激素诱导性腺发育成熟以往都是采用鲤鱼脑垂体、鲑鱼脑垂体、人绒毛膜促性腺激素等异源激素,但成熟率、受精率、孵化率都很低,而且孵化出的仔鱼不能正常发育与生长,使鳗鲡人工繁育研究进展缓慢。本研究选用毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA,成功构建了促性腺激素的表达载体并在毕赤酵母X33中表达,主要开展了以下工作:
1、以花鳗鲡脑垂体cDNA为模板分别克隆出了促性腺激素的不同亚基,即GTHα、FSHβ、LHβ亚基;并成功构建了克隆载体pGEMT-GTHα、pGEMT-FSHβ、pGEMT-LHβ,经测序证明序列与Genebank上所公布的序列均相同,分别含有完整的单亚基基因;成功构建单亚基表达载体pPICZαA-FSHβ、pPICZαA-LHβ,并在毕赤酵母X33中成功表达;
2、成功构建了双亚基表达载体pPICZαA-FSHβα、pPICZαA-LHβα,两个双亚基之间均以-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-的linker相连。该linker的作用β与α亚基之间能够提供足够的空间供亚基的折叠,形成与内源蛋白结构相近、并能与其受体结合的外源蛋白。
3、所构建的表达载体pPICZαA-FSHβα的双亚基根据毕赤酵母密码子的偏好性进行了改造,但所编码的氨基酸不变。
4、表达载体pPICZαA-FSHβα、pPICZαA-LHβα均能在毕赤酵母中成功表达,便于进行下一步功能、抗体等方面的研究,不仅充实花鳗鲡生殖内分泌学,而且可为花鳗鲡及其他鳗鲡人工繁育打下坚实基础。