论文部分内容阅读
研究背景:胃癌高居全球癌症发病率的第四位、死亡率第三位。据统计,全球每年约新增胃癌病例一百万人次,且将近88%的病例出现在发展中国家,尤其是中国等处于东亚的发展中国家。手术切除仍然是临床上治疗胃癌的首选方法,但对于中晚期患者该方法却不能有效改善患者预后。分子靶向治疗是近几年发展迅速的一种新型胃癌治疗方式。目前,虽然临床上应用的胃癌靶向药物有很多,例如以HER2、VEGF、EGFR和mTOR等为靶标药物,但均存在靶向效率低、个体耐药性高等缺点。因此,寻找一种新型的分子靶向药物来改善胃癌患者的治疗刻不容缓。丙戊酸(VPA)是一种临床上用于治疗癫痫和双向情感障碍的神经类药物。同时,它也是一种特异性的组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂,可以抑制肿瘤细胞的增殖、诱导凋亡的发生。大量的研究显示,VPA在抑制血液系统肿瘤和神经系统肿瘤方面具有较好的药效,但在治疗胃癌方面则尚无报道。研究目的:通过体外实验探讨VPA对于胃癌细胞生物学功能的影响,并阐明其可能的分子机制。材料和方法:应用噻唑蓝实验(MTT)检测VPA对于不同分化程度的4种胃癌细胞株AGS、MKN-28、MKN-74和SGC-7901活性的抑制作用,并筛选出对VPA较为敏感的细胞株进行后续实验。应用平板克隆实验和Western blot实验检测VPA对于胃癌细胞增殖能力的影响;应用流式细胞术和Hoechst荧光染色检测在VPA的作用下,胃癌细胞发生凋亡的情况;利用Western blot实验分析其发生凋亡涉及到的途径以及相关凋亡蛋白的表达情况;应用免疫荧光染色(IF)、吖啶橙染色(AO)、电子显微镜观察以及Western blot实验检测VPA药物处理后胃癌细胞发生自噬的情况以及相关蛋白的表达变化;应用Western blot实验检测VPA用药后PI3K/AKT/mTOR信号通路的变化情况,以探索VPA在抑制胃癌细胞增殖过程中所涉及的作用机制。结果:1.MTT的结果显示,VPA可抑制胃癌细胞的活性且呈浓度依赖性,同时筛选出AGS和SGC-7901作为进一步实验的细胞株;平板克隆实验结果显示,VPA可以有效抑制胃癌细胞的增殖和克隆形成能力;Westemblot实验的结果显示,进行VPA处理后,胃癌细胞的Ki67和SKP2蛋白表达水平显著下调。2.Hoechst实验结果表明,与对照组相比,VPA用药组的细胞出现了明显的核凝聚现象;进一步通过流式细胞实验证实VPA可以诱导胃癌细胞发生凋亡;Western blot实验的结果显示,VPA可以上调Bax和cleaved-PARP蛋白的表达,下调Bcl2和PARP蛋白的表达,活化caspase3、caspase8和caspase9,进而诱导凋亡的发生。3.吖啶橙染色的结果显示,与对照组相比,VPA用药组的细胞随着用药时间的延长其胞浆内自噬小泡的数量明显增多;应用电子显微镜进行观察,结果在VPA用药组细胞内发现大量的橙红色嗜酸性小泡;Western blot和免疫荧光染色实验的结果显示,VPA可以上调Beclin-1蛋白的表达,促进LC3-I向LC3-II的转化,进而诱导自噬的发生。4.Western blot实验的结果显示,VPA抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路,上调PTEN蛋白的表达,下调AKT、S6、mTOR和4EBP1蛋白的磷酸化水平。结论:1.VPA可以体外抑制胃癌细胞的增殖,诱导凋亡和自噬的发生;2.VPA可以通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路杀伤胃癌细胞。