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莽草酸(shikimic acid)是芳香族氨基酸合成中的重要中间产物，具有广泛的药用价值，是抗流感药物“达菲”的重要合成前体。微生物发酵生产莽草酸具有许多优点，其中大肠杆菌常应用于微生物大规模发酵生产。通过对大肠杆菌进行代谢工程改造，是构建工业化莽草酸高产菌的主要技术手段。该方法不仅生产周期短、成本低、而且对环境污染少。本文旨在获得莽草酸基因工程菌，实验设计方案是阻遏莽草酸代谢与支路途径消耗，以及强化莽草酸代谢途径。 为此本实验的研究工作为: (1)利用Red同源重组技术成功构建莽草酸激酶AroL与AroK失活的重组菌株E.coli SHIK△aroL、E.coli SHIK△aroK、E.coli SHIK△aroL△aroK，以阻断莽草酸代谢。并通过发酵实验，比较了各菌株的生长和产物生成情况，发现E.coliSHIK△aroL菌株莽草酸合成量较高，生长状况最好。 (2)为减少代谢支路消耗，在E.coli SHIK△aroL基础上，继续利用Red同源重组技术成功构建奎尼酸/莽草酸脱氢酶YdiB失活的重组菌株E.coliSHIK△aroL△ydiB，成功减少副产物的产生。 (3)构建过表达质粒pTrc99A-aroG、pTrc99A-aroGE、pTrc99A-aroGED、pTrc99A-aroGEDB，以增强莽草酸途径的代谢流量。 (4)为防止质粒过载，还构建了pSTV28-aroB，分别与pTrc99A-aroG、pTrc99A-aroGE、pTrc99A-aroGED，建立双质粒系统。 (5)将上述的质粒导入E coli SHIK△aroL与E coli SHIK△aroL△ydiB菌株，建立莽草酸基因工程菌。通过发酵实验发现，单质粒表达系统中菌株E.coliSHIK△aroL△ydiB/pTrc99A-aroGEDB产量最高，双质粒表达系统中E.coliSHIK△aroLydiB/pTrc99A-aroGE/pSTV28-aroB产量最高。 (6)利用单因素实验与正交试验初步优化摇瓶发酵培养基。确定培养基为:葡萄糖8g/L，酵母粉1.0g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏1.0g/L，(NH4)2SO41.6g/L，柠檬酸2g/L,MgSO4·7H2O2g/L,K2HPO4·3H2O7.5g/L,FeSO4·7H2O2mg/L;微量元素混合溶液1mL/L，此条件下E.coliS HIK△aroL△ydiB/p Trc99 A-aroG EDB26 h产酸5.51 g/L，E.coliSHIK△aroL△ydiB/pTrc99A-aroGE/pSTV28-aroB26 h产酸5.75g/L。 (7)实验还进行了大肠杆菌耐受性实验，发现大肠杆菌在高浓度莽草酸环境下生长受到抑制。 通过代谢工程改造成功实现大肠杆菌积累莽草酸，为今后的继续改造工作奠定基础。