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口蹄疫(Foot-and-MouthDiseaseFMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-MouthDiseaseVirusFMDV)引起的偶蹄兽一种急性、热性、高度接触性传染病,该病传播速度快,宿主范围广,发病率高,主要侵害猪、牛、羊等70多种家畜和野生动物,偶见于人和其他动物。本病在世界各地均有发生,目前虽有不少国家已消灭了本病,但在非洲、亚洲和南美洲很多国家仍有本病流行。本病有强烈的传染性,一旦发病,传播速度很快,往往造成大流行并且在流行过程中,猪对本病的传播过程中起着重要的作用,不易控制和消灭,带来严重的经济损失,因此,世界动物卫生组织(OIE)一直将本病列为发病必须报告的A类动物疫病名单之首。
FMDV属于小RNA病毒科、口疮病毒属,单股正链RNA病毒,具有很高的变异能力,每年还会有新的亚型出现。各型之间在临诊表现方面没有不同,但彼此均无交叉免疫性,给本病的检疫、防疫带来很大困难。FMDV分为7个血清型(O、A、C、AsiaⅠ、SAT1、2、3型),我国流行的FMDV主要是O、AsiaⅠ型。
本试验从Genbank中分别下载猪β-actin和146条O和AsiaⅠ型RNA基因组序列,应用MEGA4软件分析其序列。根据TaqMan探针设计原则,利用软件Beacondesigner7.0在猪β-actin和FMDV2B保守区各设计了一套引物和探针,建立了快速检测O和AsiaⅠ型的实时荧光定量RT-PCR方法。同时将两段目的片段分别插入T载体,构建重组质粒,为所建立的实时荧光定量RT-PCR方法提供阳性质粒,并对该方法进行条件优化,引物浓度分别为0.8μL(10pmol/μL)和1.0μL(10pmol/μL);探针浓度分别为0.6μL(10pmol/μL)和0.5μL(10pmol/μL);dNTP浓度均为2.5μL(2.5mM);退火温度均为55℃。该方法特异性试验显示,此方法不与猪圆环病毒Ⅱ型(PCVⅡ)、猪瘟病毒(CSFV)、牛病毒性腹泻(BVDV)、猪细小病毒(PPV)、猪流行性腹泻(PED)、猪传染性胃肠炎(TGE)、猪伪狂犬病毒(PRV)、山羊痘病毒(Goatpox,GPV)、小反刍兽疫(PPRV)、猪呼吸与繁殖综合症(PRRSV)发生交叉反应,检测阳性质粒的灵敏度分别达到19和10个拷贝,同时分别制作的标准曲线,线性范围较宽,标准曲线的扩增效率为94％和108％,相关系数为0.996和0.993,标准方程为Y=-3.486+42.162和Y=-3.152x+44.961,批内、批间的变异系数(CV)均小于5％。
综上所述,本试验建立了具有良好特异性、敏感性、重复性的口蹄疫病毒TaqMan荧光定量RT-PCR方法。该方法既可以作为临床样品检测的重要手段,同时也是实验室研究的基本工具之一。