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眼镜蛇毒的化学成分复杂,含有多种蛋白质、多肽、酶类和其它小分子物质,具有广泛的生物学活性。蛇毒应用于镇痛已有70年历史,早在二十世纪初,人们就开始应用蛇毒来缓解恶性肿瘤疼痛、神经痛和关节痛。获得单一的镇痛活性成分是理化性质分析、药理活性研究和临床应用的前提。传统分离眼镜蛇蛇毒的方法都是利用阳离子交换层析,凝胶过滤以及反相高效液相相结合的方法,过程繁复,耗时长且回收率低。
近几年一种新的仿生亲和层析配基由中国科学院上海生物工程研究中心设计。他们利用Brookhaven蛋白数据库,以来自舟山眼镜蛇(Naja naja atra)的短肽链神经毒素cobrotoxin的氨基酸序列为基础,通过Tripos公司的分子模拟软件对其进行分子的结构模拟,发现一个比较有特征的位点:氨基酸残基Lys27,Glu38,Tyr25形成一个凹陷的边缘。一个苯分子正好可以放入该位点的凹陷中,于是他们以此为出发点,设计出一系列亲和配体,最后经合成,鉴定,筛选,发现所合成的亲和介质的确能吸附某些具有镇痛活性的成分,但有趣的是,随着镇痛成分进一步纯化,测序,又发现所分得的物质并不是神经毒素,而是心脏毒素,并推论心脏毒素也有作为镇痛药物开发的潜力,通过一步亲和层析,分离产物的纯度为35%~92%,回收率达64%。在应用该方法的过程中我们发现如下现象:
1.应用一步仿生亲和层析所得的蛋白回收率约为18%,纯度为39%。
2.先经其它方法纯化过的粗毒再用亲和层析分离时,会吸附更多的杂蛋白。
3.在一步亲和层析后,A2分别被离子交换(UND sphere S)、凝胶过虑(Sephadex G-50)及疏水层析(Phenyl Sepharose CL-4B)分离为2个峰、3个峰、4个峰。
4.用疏水层析进一步分离后,得到4个峰,其中第2个含量最小的峰镇痛活性最强,回收率仅占粗毒的1.2%,将此成分命名为AH2。
5.通过SDS-PAGE、HPLC和氨基酸测序的方法,得到AH2纯度为98%,是一个分子量在6.5~8.0kDa的蛋白。应用生物信息学工具对AH2氨基酸序列进行分析后发现,本文所研究的蛇毒镇痛蛋白AH2与蛇毒中的心脏毒素亚型CTXⅣ相似性达到100%。而此序列与中国科学院上海生物工程研究中心运用此方法分离纯化所报道氨基酸序列并不相同,序列的N端第一个氨基酸存在差别。