对虾是最重要的海水养殖产品之一,但是自从1990年代以来,一直受到病害的严重威胁,尤其是对虾白斑综合症病毒(White spot syndrome virus, WSSV),已成为危害对虾养殖的最主要病原。因此,充分了解对虾的非特异性免疫系统,从而探索对虾病害防治的新途径具有重要意义。本实验室在以前的研究中,通过抑制差减杂交(SSH)发现了日本对虾中一段与细胞凋亡相关的基因序列,为了进一步了解该基因在对虾抗病毒免疫中的作用,本论文开展了该基因的功能研究,以期为对虾病毒病的防治提供依据。通过5’和3’RACE技术,从日本对虾中获得了该基因的cDNA全长,它含有一个预测的开放阅读框(ORF),长度为1524bp,编码508个氨基酸,与caspase蛋白酶家族具有同源性,因此将其命名为PjCaspase基因。相应的DNA分析发现,PjCaspase基因含有两个内含子,三个外显子。采用Genome walker技术获得了该基因的启动子,并进一步验证了其功能。将PjCaspase基因克隆至原核表达载体pGEX-4T-2中,获得了重组蛋白。研究表明,纯化的重组蛋白具有蛋白酶活性,证明PjCaspase具备Caspase的基本性质。通过RT-PCR、Northern blot和Western blot等分析发现,该基因在除心脏外的其他组织中均有转录表达。用WSSV病毒刺激后,在不同时间提取病毒对虾和抗病对虾肝胰腺总RNA,进行Real-time PCR分析,结果发现PjCaspase基因在抗病对虾中上调表达,说明该基因参与了对虾抗病毒的免疫过程。为了进一步了解PjCaspase在细胞凋亡中的作用,采用RNAi技术抑制PjCaspase基因的表达。结果表明,当PjCaspase基因的转录表达受到抑制时,对虾的细胞凋亡也受到抑制,这说明PjCaspase基因直接参与细胞凋亡。本论文初步研究发现,对虾Caspase具有基因多样性,抗病对虾中Caspase蛋白序列的变化,低于正常对虾。