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红树植物作为河口海区生态系统的初级生产者支撑着广博的陆域和海域生命系统,为海区和陆缘生物提供食物来源,并为鸟类、昆虫、鱼类贝类、藻菌等提供栖息繁衍场所,构成复杂的食物链和食物网关系。红树林生态系统高初级生产力、富含有机碎屑、沉积物颗粒细及缺氧环境等特征使其成为吸收和蓄积多环芳烃等污染物的重要场所。PAH(polycyclic aromatic hydrocarbon,多环芳烃)是一类重要的环境污染物,因其持久性、难降解性、致毒性和致畸诱变作用受到国际社会越来越多的关注。但目前关PAH在红树林领域的研究报道大多局限于分析红树林湿地沉积物中PAH的种类、含量、来源及微生物对PAH的降解作用,而对红树林湿地的核心主体-红树植物在PAH污染胁迫下的毒理效应的研究极少见报道。因此,研究红树植物抗多环芳烃胁迫生理生化特征及其分子生态学机制,为受损红树林生态系统修复及其资源保护提供科学依据和技术支持。
本研究针对四种主要红树植物木榄、秋茄、红海榄、桐花树,综合运用生物化学、分子生物学和实时定量PCR技术对在PAH胁迫下红树植物体内的抗氧化防御酶系统、抗氧化酶相关基因、细胞色素P450酶基因和PAH降解防御相关基因的实时定量表达进行了研究,在以下五个方面取得了重要成果和发现:
(1)通过在PAH胁迫下对红树植物叶茎根不同部位的抗氧化系统相关指标的研究表明,红树植物秋茄和木榄在PAH胁迫下都会导致其体内产生氧化胁迫环境,不同红树植物的防御体系表现出明显的器质特异性特征,而且不同的PAH种类对植物的影响也不同。芘胁迫对木榄的毒害远大于芘和对三联苯对秋茄的毒害。相关分析表明,MDA为指示PAH胁迫的良好指标。而在芘胁迫作用木榄时,SOD和APX活性也和PAH处理强度成明显的相关关系,是表征芘胁迫的良好生物学参数。
(2)红树植物叶片不同RNA提取方法研究表明:CTAB-LiCl法和CFAB-异丙醇沉淀法改良后能有效提取得到白骨壤、木榄和秋茄叶片的总RNA,但是产率偏低。Invitrogen提取试剂在四种植物总RNA的提取效果优于Tiangen和Takara,但是其价格也比较昂贵。因此改良后的Tiangen提取试剂,价格低廉,是提取红树植物叶片试剂盒的良好选择。
(3)萘胁迫下抗氧化酶相关基因实时定量结果表明三种红树植物(木榄、秋茄、红海榄)在萘胁迫下抗氧化酶基因普遍被诱导,而且在转录水平表现出了协调一致的表达特征,而叶部MnSOD-APX两基因的协调性均高于其他基因的相关性,为红树植物叶部防御ROS的主要酶基因。红树植物体内ROS调控基因网络具有高度的灵活性,不同植物之间各有自己的表达特征。木榄中茎和根中两两基因表达水平之间,如MnSOD-CAT、POD、APX、GST,CAT-POD、APX、GST,POD-APX、GST,APX-GST均表现出高度相关的关系,相关系数均在0.90以上,木榄根部各酶基因的表达均普遍受到抑制,而茎部基因的表达均表现出在低浓度时升高,在高强度PAH胁迫下降低的变化趋势。而秋茄根部和红海榄茎部的变化与木榄茎部的变化类似。说明不同红树植物的抗氧化酶体系在多环芳烃胁迫下分子水平上表现出不同的防御机制。研究表明,不同红树植物不同组织器官在萘胁迫下敏感性不同,木榄为根>叶>茎;而秋茄为叶>根>茎;红海榄则为茎>叶根,叶根之间的差距则不大。
(4)PAH胁迫下细胞色素P450酶系统的C4H基因的表达普遍受到诱导,表明CAH酶基因的表达在植物抗性方面具有一定程度的广适性,是构成植物抵抗外界逆境胁迫的重要支撑系统。而本研究的相关分析表明,萘胁迫的强度和C4H基因、MnSOD基因和POD基因在秋茄叶部的表达量成明显的正相关性,均是指示萘胁迫强度的良好指标。结合抗氧化酶基因中秋茄的相关分析表明,在萘胁迫下秋茄相比木榄和红海榄反应更加敏感。而对于GST和C4H基因之间在木榄和红海榄叶根部位以及秋茄根部都表现出高度的正相关关系,在P<0.05显著水平下,相关系数均在0.90以上,说明两个基因在PAH胁迫下具有协调一致性,也在侧面说明了两个基因可能在PAH的解毒方面具有重要的作用。
(5)萘胁迫下桐花树叶茎根PPO转录水平的研究结果表明,PPO基因在桐花树中叶茎根的反应变化相似,在低浓度时(N1-N3),其表达水平没有明显变化或者略有降低。但在高强度的PAH处理下(N4-N5),其表达水平则被强烈诱导,表达量大量增加。根茎叶中对PAH的响应程度则没有太大的差异。这种结果与木榄、红海榄及秋茄中抗氧化酶基因和细胞色素P450酶系统的变化又有不同。而决定脯氨酸合成的速度的关键酶基因P5CS的表达则具有明显的器质特异性特征。
总之,本研究在生理生化水平揭示了PAH胁迫下红树植体内不同防御体系的反应变化特征,并运用实时定量PCR技术在基因表达水平探究了不同基因的表达调控特征,为进一步深入了解红树植物耐受多环芳烃污染的机理和内在机制提供重要的科学参考价值。