背景与目的： 结肠癌是常见的恶性肿瘤。结肠癌手术前或术后转移发生率高，这样，多数患者失去手术治愈的机会。化学治疗是进展期结肠癌的主要治疗手段，但耐药性的产生常导致结肠癌化疗失败。尽管新的化疗药物和联合方案不断推出，但疗效并没有明显提高。因此，仍迫切需要探寻治疗结肠癌和提高化疗效果的新策略。 活跃的糖酵解代谢是恶性肿瘤细胞显著的生化特征，是肿瘤细胞能量ATP的重要来源。即使在有氧条件下，糖酵解代谢仍明显活跃。肿瘤细胞这一特殊生化表型，被称为warburg效应。临床上已利用肿瘤细胞特异性的Warburg效应，通过正电子发射断层显像(positronemissiontomography，PET)技术来诊断恶性肿瘤，而探索通过干预糖酵解代谢途径来治疗恶性肿瘤的策略正备受关注。 本课题拟通过抑制HK-Ⅱ，观察结肠癌细胞增殖、化疗敏感性和凋亡相关因子的变化，以探讨HK-Ⅱ在结肠癌细胞增殖和化疗中的作用及机制；通过抑制mTOR，观察结肠癌细胞增殖、化疗敏感性以及HK-Ⅱ表达的变化，以探讨mTOR信号通路对结肠癌细胞HK-Ⅱ表达的调控机制。 方法： 1.采用RT-PCR和Western印迹法，检测4种人结肠癌细胞株HK-Ⅱ基因和mTOR基因mRNA和蛋白表达。 2.应用MTT、DNA琼脂糖凝胶电泳、Hoechst33258核染色及比色法，观察HK-Ⅱ阻断药物(3-bromopyruvicacid，5-BrPA)对结肠癌细胞增殖、凋亡和化疗的影响。通过流式细胞仪检测线粒体膜电位(mitochondriamembranevoltage，Aψm)、紫外分光光度计测定线粒体膜通透转换孔(permeabilitytransitionpores，PTP)开放及Western印迹法检测线粒体结合型HK-Ⅱ表达，探讨5-BrPA拮抗HK-Ⅱ与线粒体结合导致的细胞凋亡机制。 3.构建靶向HK-Ⅱ基因的短发夹RNA(shorthairpinRNA，shRNA)真核表达质粒(pGenesil-1-HK-Ⅱ)，稳定转染结肠癌LoVo细胞。实验分三组：1组为正常培养组LoVo细胞，2组为转染质粒pGenesil-1-HK-Ⅱ的LoVo细胞阳性实验组，3组为转染质粒pGenesil-1的LoVo细胞阴性对照组。采用MTT法、流式细胞仪、Western印迹法及高效液相色谱仪(highperformanceliquidchromatography，HPLC)，检测结肠癌LoVo细胞增殖、克隆形成能力、细胞周期、细胞内ATP含量、胸苷酸合成酶(thymidylatesynthase，TS)以及化疗敏感性的变化。将上述三组LoVo细胞接种于裸鼠背部皮下，4周后测量皮下瘤体积和称重，免疫组织化学染色法检测肿瘤组织Ki-67表达，TUNEL法分析细胞凋亡。 4.在体外细胞培养实验中，通过mTOR阻断剂(雷帕霉素，rapamycin)和RNA干扰(RNAinterference，RNAi)技术抑制mTOR，应用MTT法检测结肠癌细胞增殖、化疗敏感性变化，以及rapamycin与3-BrPA的联合抗癌效应；并用Western印迹法分析结肠癌LoVo细胞HK-Ⅱ表达变化。在体内实验中，将LoVo细胞接种于裸鼠背部皮下，4周后测量皮下瘤体积并称重，免疫组织化学染色法检测肿瘤组织mTOR、HK-Ⅱ和Ki-67表达，TUNEL法检测细胞凋亡。 结果： 1.HK-Ⅱ和mTOR基因mRNA和蛋白在结肠癌HCT-116、LoVo、HT-29和SW480细胞中均明显表达。 2.不同浓度(50、100、150、300μmol/L)3-BrPA分别作用LoVo、HCT-116、HT-29、SW480细胞48h，结肠癌细胞增殖均受到明显抑制。小剂量3-BrPA(25μmol/L)分别与低剂量化疗药物(5-FU和L-OHP)联合作用LoVo细胞48h。检测显示，小剂量3-BrPA单独作用LoVo细胞的48h细胞增殖抑制率为(8.4±2.1)％；5-FU(1.25、2.5μg/ml)与之联合应用48h，细胞增殖抑制率则由(19.2±2.3)％和(40.6±1.9)％分别提高到(40.0±2.9)％和(56.6±2.8)％(均P＜0.01)；而L-OHP(0.5、1.0μg/ml)与之联合应用48h，细胞增殖抑制率则由(19.2±6.1)％和(32.2±2.2)％分别提高到(48.4±3.2)％和(60.5±4.6)％(均P＜0.01)。 3.DNA片段琼脂糖凝胶电泳法、Hoechst33258核染色法和比色法检测显示，3-BrPA可诱导结肠癌LoVo细胞凋亡。3-BrPA可拮抗结肠癌LoVo细胞HK-Ⅱ与线粒体的结合。3-BrPA和CaCl2诱导的线粒体PTP开放程度分别为(40.0±3.5)％和(37.4±2.3)％(P=0.348)，提示3-BrPA抑制HK-Ⅱ可诱导结肠癌LoVo细胞线粒体PTP开放。100μmol/L3-BrPA作用结肠癌LoVo细胞1、3、5h，细胞线粒体膜电位下降率分别为12.69％、15.38％和26.82％。 4.RNAi技术可特异性沉默LoVo细胞HK-Ⅱ基因表达，mRNA和蛋白水平表达抑制率分别为72.1％和71.2％。沉默HK-Ⅱ基因表达可使LoVo细胞体外生长和克隆形成能力明显下降。与正常培养的LoVo细胞相比，HK-H-RNAi的LoVo细胞其G0/G1期细胞数增加12.4％，S期的细胞数减少8.4％，细胞凋亡率增加9.1％(均P＜0.01)。HK-Ⅱ-RNAi的LoVo细胞ATP含量明显低于正常培养的LoVo细胞(1.5±0.2nmol/106cell比2.5±0.2nmol/106cell，P＜0.01)。与正常培养的LoVo细胞比较，HK-Ⅱ-RNAi的LoVo细胞5-FU和L-OHP的IC50值均明显降低(4.70±0.40μg/ml比11.93±0.15μg/ml，6.27±0.59μg/ml比9.77±0.60μg/ml)，TS蛋白表达水平下降，caspase-3活性则显著增高。 5.裸鼠体内实验中，HK-Ⅱ-RNAi的LoVo细胞皮下瘤平均体积和平均重量均明显小于正常培养的LoVo细胞(P＜0.01)。与正常培养的LoVo细胞组比，HK-Ⅱ-RNAi的LoVo细胞皮下瘤增殖指数显著下降(33.00±3.16比44.03±3.08，P＜0.01)，而凋亡指数则明显升高(7.47±1.29比3.21±0.68，P＜0.01)。 6.不同浓度rapamycin刺激结肠癌细胞72h，细胞增殖受到明显抑制。Rapamycin(100nmol/L)单药作用LoVo细胞60h的细胞增殖抑制率为(22.6±3.7)％；低剂量3-BrPA(25、50μmol/L)与之联合用药(rapamycin预处理12h)48h，细胞增殖抑制率由(6.9±1.7)％和(13.2±3.2)％分别提高到(38.7±4.7)％和(57.5±6.6)％(均P＜0.01)。 7.Rapamycm(100nmol/L)能明显抑制LoVo细胞HK-Ⅱ蛋白表达，并可阻断表皮生长因子(EGF，10ng/ml)诱导的HK-Ⅱ蛋白表达增强效应。RNAi沉默mTOR基因表达可下调LoVo细胞HK-Ⅱ基因表达，mRNA和蛋白水平表达抑制率分别为66.1％和69.5％。mTOR-RNAi的LoVo细胞裸鼠皮下瘤组织mTOR和HK-Ⅱ表达也明显降低。 8.与正常培养的LoVo细胞比较，mTOR-RNAi的LoVo细胞5-FU和L-OHP的IC50值均明显降低(6.53±0.60μg/ml比11.93±0.15μg/ml，7.03±0.65μg/ml比9.77±0.60μg/ml，均P＜0.01)。RNAi下调mTOR表达可明显抑制结肠癌LoVo细胞体内外增殖。与正常培养的LoVo细胞相比，mTOR-RNAi的LoVo细胞皮下瘤增殖指数显著下降(27.65±3.03比44.03±3.08，P＜0.01)，而凋亡指数则明显升高(8.77±1.46比3.21±0.68，P＜0.01)。 结论： 1.HK-Ⅱ阻断剂3-BrPA可通过拮抗HK-Ⅱ与线粒体结合、降低线粒体膜电位、增加线粒体膜通透性等机制来诱导结肠癌细胞凋亡。 2.RNAi技术可特异性阻断结肠癌LoVo细胞HK-Ⅱ基因表达，通过减少细胞内ATP合成和增加细胞凋亡途径来抑制LoVo细胞体内外增殖。 3.抑制HK-Ⅱ可通过诱导线粒体膜通透转换孔开放、降低线粒体膜电位、活化caspase-3、增加细胞凋亡以及减少胸苷酸合成酶表达等机制来增强结肠癌LoVo细胞对化疗药物的敏感性。 4.mTOR信号通路可通过调控HK-Ⅱ表达来影响结肠癌LoVo细胞增殖和化疗敏感性。 5.联合抑制mTOR和HK-Ⅱ对LoVo细胞有协同杀伤作用，提示可通过多靶点干预细胞糖酵解途径治疗结肠癌。