SELEX法筛选果蝇神经特异性拼接因子Dxl6的配体

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前体 mRNA 的选择性剪接发生频率很高,它在人类基因组中广泛存在,是增加蛋白质多样性及基因表达复杂程度的主要原因。近来研究显示,一些富含丝氨酸和精氨酸蛋白(SR 蛋白)对于剪接的顺利完成有着至关重要的作用。SR 蛋白是具有帮助识别正确剪接位点并促进剪接体的成熟的一类重要剪接因子,为组成性剪接所必需,在选择性剪接中更起着不可替代的作用。 Dx16基因是 2000 年克隆的一种新基因。根据氨基酸序列和核酸序列推测它可能是剪接因子的候选基因。原位杂交显示,Dx16基因主要在后期胚胎的神经系统表达,与神经发育相关。诱变剂 EMS (甲基磺酸乙酯)所致 Dx16 的 2 核甘酸缺失突变导致果蝇胚胎后期或 1 龄幼虫致死。P 因子插入突变(插入内含子区域)引起三龄幼虫或后期蛹致死,但约有5﹪的逃逸者,这些逃逸者发育延迟并发有刚毛、翅膀、眼睛、腿等器官的发育异常。为了深入研究Dx16蛋白的功能,了解其在果蝇胚胎和胚胎后期及神经系统发育中的作用,本文用SELEX方法筛选到了 Dx16 可能的作用靶序列。 首先,将Dx16氨基端含两个 RNA 识别基序的基因片段构建入原核表达载体,通过摸索各种条件,成功地以可溶的形式表达了融合蛋白,并用 GST 亲合层析柱进行了纯化,给后续的实验提供了较好的工具。 其次,经分离纯化的Dx16N-GST 融合蛋白与RNA文库在一定条件下孵育结合,共进行六轮 SEIEX 筛选,得到了Dx16可能作用的靶序列,并用 EMSA 验证了它们之间的相互作用。 最后,用生物信息学分析了筛选到的Dx16可能作用的靶序列的二级结构、一致基序及所在的候选基因,并用 RT-PCR 检测部分候选靶基因在Dx16功能缺陷的突变果蝇中的表达状态,以及Dx16 对这些底物的剪接方式和表达水平的影响,为下面的体外剪接实验奠定了基础,从而也为探讨 Dxl6 的调控机制及其在发育中的作用提供数据。
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