背景:超声空化效应作为超声波的重要生物学效应之一,一直是超声医学研究的重点。近年来随着各种微泡超声造影剂的研制和推广应用,微泡增强的超声空化及其相关的生物学副作用和治疗作用,已成为超声医学领域一个感兴趣的研究课题。一方面,微泡造影剂作为外源性空化核一旦进入循环后,生物体的声环境发生变化,空化阈值显著下降,空化生物学损伤作用显著增强;另一方面,微泡超声造影剂又可以作为携带药物和基因的载体,利用超声空化微泡实现药物和基因的定点传递和释放,达到靶向治疗疾病的目的。正是由于微泡增强的超声空化具有治疗和损伤两方面的作用,因此如何合理、安全地利用微泡增强的超声空化就显得十分重要。近几年,已陆续有超声空化的生物学副作用方面的报道。Li等发现,经静脉注射微泡超声造影剂后,在高机械指数诊断超声作用下,大鼠心肌微血管通透性增高,表现为伊文思蓝(EB,一种血管示踪剂)大量漏出血管外,在超声辐照区域形成出血淤斑,同时诱发室性早搏;而且随着微泡剂量和超声强度增加,以上生物学副作用也随之增强。Miller等进一步发现心肌细胞被EB染色,证明心肌细胞在声学造影中也受到损伤,并且在心脏负荷试验时,心肌细胞染色的数量会明显增多,以及心肌局部炎性细胞渗出。本课题组既往研究显示,用脂质微泡对较大动物模型(兔)进行心脏超声造影时,可发生心肌微血管通透性增高等生物学效应,而且超声显像模式和动物心率是心肌微血管通透性的独立影响因素。但是,针对心肌血管通透性的病理观察仅局限于光镜水平,不能很好的解释其病理基础,有必要进一步进行超微结构的病理观察。Miller等虽然研究了心脏负荷实验的超声造影副作用,但仅局限于心肌细胞损伤,对于心脏负荷实验情况下心脏超声造影的微血管损伤作用缺乏研究。因此,本课题以期在以往研究的基础上,进一步了解心肌微血管的显微水平和超微结构的病理改变,以及负荷状态下心脏超声造影所产生的血管损伤副作用,对不同影响因素下心脏超声造影中的心肌微血管损伤提供病理形态学支持。研究目的:1.观察对比在负荷和静息状态下进行心脏超声造影时,微泡超声空化对心肌微血管的损伤效应;2.通过光镜和电镜观察,发现在心脏超声造影中,微泡超声空化产生心肌细胞损伤、微血管通透性增高以及血管壁损伤的病理基础。研究方法:1.实验材料:实验仪器:GE Vivid 7彩超诊断仪,探头选择M3S,频率1.75 MHz,机械指数(MI)1.3。实验试剂:脂膜微泡“脂氟显”,核心气体为全氟丙烷,平均粒径2μm,其中98﹪小于8μm,浓度约为7×109/ ml;实验动物:健康新西兰大白兔92只,平均体质量2.0 kg。2.实验方法:(一)实验分组表1.实验各组和处理方法分组微泡剂量(ml/kg)例数麻醉剂超声显像方式单纯微泡组0.5 12速眠新无单纯超声连续组0 12速眠新诊断超声连续发射单纯超声触发组0 12速眠新诊断超声2 S触发静息造影连续组0.5 14速眠新诊断超声连续发射静息造影触发组0.5 14速眠新诊断超声2 S触发负荷造影连续组0.5 14速眠新诊断超声连续发射负荷造影触发组0.5 14速眠新诊断超声2 S触发(二)观察内容(1)心电监测:在超声造影过程中,进行全程心电监测,记录有无室性早搏发生及出现的次数;(2)血管通透性:以伊文思蓝作为血管通透性改变的示踪剂,大体病理观察伊文思蓝在心肌的漏出范围及心肌出血,视觉评分分析伊文思蓝在心肌的漏出范围及分析心肌出血;并通过甲酰胺淬取出心肌组织中的伊文思蓝,检测单位质量心肌的伊文思蓝含量,评价静息和负荷情况下的心脏超声造影对心肌微血管通透性改变的影响;(3)病理检查:分别用光镜和电镜观察微泡超声空化对心肌微血管及心肌细胞的损伤情况,从细胞水平及超微结构上了解心脏超声造影的心肌微血管通透性改变的病理基础。结果:1.心电监测结果:单纯微泡组、单纯超声连续组、单纯超声触发组中未出现室性早搏;其余各造影组中均出现0～100次不等的室性早搏,但各造影组之间早搏出现的次数无统计学差异(P >0.05)。2.各组单位质量心肌伊文思蓝定量检测结果:单纯微泡组、单纯超声连续组、单纯超声触发组EB漏出量显著低于各造影组(P<0.01);静息触发组、负荷连续组、负荷触发组的EB漏出量高于静息连续组(P<0.01);静息触发组、负荷连续组、负荷触发组三组之间比较无统计学差异(P >0.05)。3. EB漏出的视觉评分和心肌出血视觉评分结果:(1)在EB漏出视觉评分中,单纯微泡组、单纯超声连续组和单纯超声触发组未见EB漏出,视觉评分为0级,明显低于各造影组(1-3级)(P<0.01);负荷触发组EB漏出视觉评分均为3级,显著高于其他造影组(1-3级)(P<0.01);。(2)在心肌出血的视觉评分中,单纯微泡组、单纯超声连续组、单纯超声触发组和静息连续造影组无明显肉眼心肌出血,评分为0级,明显低于其他造影组(0-2级),(P<0.01);负荷触发组心肌有大片显著的心肌出血,视觉评分为3级,明显高于静息触发组和负荷连续组(0-2级)(P<0.01)。4.病理学检查结果(1)光镜检查结果单纯微泡组、单纯超声连续组和单纯超声触发组:仅可见部分毛细血管充血,无明显病理改变。静息连续组:心肌肌束及心肌细胞间隙偶可见散在红细胞漏出,并可见散在的淋巴细胞及中性粒细胞渗出,可伴有毛细血管充血。静息触发组:心肌肌束及心肌细胞间隙以散在的红细胞漏出为主,部分可见较多的红细胞漏出,心肌细胞间隙可见局灶性淋巴细胞及散在中性粒细胞渗出;多发生在心肌毛细血管周边,可伴有毛细血管充血。负荷连续组:心肌肌束及心肌细胞间隙可见较多的红细胞漏出,心肌细胞间隙可见局灶性淋巴细胞及散在中性粒细胞渗出,多发生在心肌毛细血管周边;可伴有毛细血管充血。负荷触发组:心肌肌束及心肌细胞间隙可见大量红细胞漏出,多发生在心肌毛细血管周边;左室前壁心肌细胞Z线略模糊;毛细血管内充血。除负荷触发组心肌细胞出现可疑损伤外,其余各组均未出现心肌细胞明显损伤。(2)电镜检查结果:单纯微泡组、单纯超声连续组和单纯超声触发组:毛细血管内皮细胞排列整齐,基底膜连续性完整;心肌细胞间隙未见红细胞。静息连续组:毛细血管一侧内皮细胞和基底膜连续性中断,微孔形成;另一侧内皮细胞排列基本整齐,基底膜连续性完整;心肌细胞间隙偶见红细胞。静息触发组:毛细血管一侧内皮细胞可见轻度肿胀,内皮细胞和基底膜连续性中断,微孔形成;另一侧内皮细胞排列基本整齐,基底膜连续性完整;心肌细胞间隙可见散在红细胞和淋巴细胞。负荷连续组:毛细血管内皮细胞可见一侧高度肿胀,可见紧密连接出现间隙,内皮细胞和基底膜连续性中断;心肌细胞间隙可见散在红细胞及淋巴细胞。负荷触发组:毛细血管一侧内皮细胞高度肿胀、紧密连接处出现间隙,甚至内皮细胞及基底膜结构紊乱崩解;心肌细胞间隙可见较多的红细胞。心肌细胞肌膜下可见显著水肿。以上各组中,除负荷触发组心肌细胞出现肌膜下水肿外,其余各组均未出现心肌细胞明显损伤改变。结论:1.负荷触发状态下,高机械指数的心脏超声造影对兔心肌微血管的损伤效应比常规静息状态更为明显。2.微泡超声空化造成心肌微血管通透性改变的病理基础主要是:微血管内皮细胞和基底膜大量微孔形成,连续性中断,内皮细胞间紧密连接出现间隙。