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在临床诊断中,最关键的是能对病原体进行快速的检测。核酸是检测中最常见的靶分子,聚合酶链式反应是其常用的检测手段。然而,聚合酶链式反应是一种基于酶的反应,其试剂存在运输和储存上的困难。同时操作复杂,自动化程度低。因此开发一种快速、灵敏度高、自动化程度高的检测方法势在必行。
本论文开发了一种基于纳米材料的生物条形码技术。该技术能够快速,简便的检测样本中低拷贝的核酸分子,并能实现高通量的检测目标。在开发的过程中,本课题优化了纳米金探针的制备方案。在纳米金探针的制备过程中加入高浓度NaCl的处理过程。由此方法制备的探针能稳定的存在于高温和高盐的溶液中,同时使用该探针的非特异信号只有普通纳米金探针非特异信号的30%。在此基础上,优化了生物条形码技术的杂交方案,提高了杂交效率。在杂交液NaCl终浓度为1.5mol/L,和杂交温度为55℃的条件下,杂交反应在20分钟内完成,并且信噪比达到140:1。同时利用FAM荧光分子的稳定性,可以优化巯基化探针的洗脱时间,使其缩短为20分钟。
本课题在应用方面,首先实现了40分钟内检测浓度低至5pmol/L的乙肝病毒合成序列的目标。随后开发了多重检测平台,能在40分钟内同时检测浓度低至5pmol/L的四种病原体的合成序列。最后用于质粒样本的检测,可以在40分钟内检测浓度低至15pmol/L的质粒样本。
与传统检测方法相比,本课题优化的生物条形码技术具有快速、灵敏、特异性高和通量高的特点。同时由于该技术是非酶促反应,对试剂储存要求低,能广泛的应用于各种临床诊断场所。