论文部分内容阅读
本研究利用日本血吸虫感染早期,即14天的小鼠血清来筛选日本血吸虫童虫cDNA文库,以寻找新的编码血吸虫病诊断和候选疫苗分子的基因。经过三轮筛选后获得7个阳性克隆,阳性克隆经PCR鉴定后进行核苷酸序列测定,同源性分析,并预测基因编码蛋白的结构与功能,同时将发现的4个新基因(SjP2、SjP7、SjP11和SjP16)序列递交到GeriBank,登录号分别为EU1202646、EU121231、EU202647和EU202648。将挑选的阳性克隆SjP7插入到pET28a表达载体中,IPTG诱导重组蛋白在E.coli BL21(DE3)菌株中表达,经鉴定在上清和沉淀中均发现存在对应的重组蛋白SjP7(rSjP7),利用QIAGEN的Ni—Agarose柱分别对rSjP7的可溶和不可溶部分进行亲和层析纯化。同时通过RT—PCR和Western blot的方法检测了SjP7基因在日本血吸虫三个发育阶段的转录和表达的差异。RT-PCR实验结果显示在尾蚴、童虫和成虫中均检测到了SjP7基因转录本的存在,而Western blot的结果则显示仅在童虫阶段检测到SjP7蛋白的存在,这表明SjP7基因的表达具有显著的虫期特异性,其编码蛋白可能在血吸虫童虫发育阶段发挥着一定的作用。此外,通过免疫荧光定位技术研究了SjP7蛋白在日本血吸虫虫体内的组织分布情况,实验结果表明其主要存在于血吸虫童虫体表。通过Western blot及ELISA方法评估所获重组蛋白SjP7的免疫诊断价值:Western blot实验结果显示rSjP7能被该蛋白免疫的多抗兔血清和感染14天的小鼠血清所识别,而不能被感染42天的小鼠血清识别;而以rSjP7作为包被抗原检测日本血吸虫病人血清的间接ELISA方法,检测疫区病人血清的敏感性为75%,非疫区正常人血清的特异性达到93.3%,而与华支睾吸虫病人和并殖吸虫病人的交叉反应率分别为6.7%和5%,这些结果表明利用rSjP7检测血吸虫病患者血清中的特异性抗体具有较高的敏感性和特异性,具有血吸虫病的免疫学诊断应用潜力。最后进行小鼠保护性试验以了解rSjP7的免疫保护效果,结果显示rSjP7免疫小鼠后可诱导产生14.7%的减虫率和16.8%的肝脏减卵率。