家蚕(Bombyx mori)作为重要的经济昆虫，在农业、工业及科学研究中占有相当重要的地位。丝腺是家蚕合成和分泌丝物质的特殊器官，与其经济性状紧密相关。家蚕丝腺细胞高强度的蛋白合成能力、特化的细胞内环境以及特殊的生理发育过程，使其成为众多研究者关注的焦点。本研究期望通过丝腺细胞程序性死亡研究来探寻调控丝腺高效分泌丝蛋白的机理，并将这些机理应用于家蚕的实际生产之中。 一、家蚕丝腺细胞程序性死亡。 家蚕在化蛹时其丝腺会经历程序性细胞死亡的过程，在这一过程中该组织在形态学上发生了很大的变化，如出现细胞皱缩、核固缩、基因组DNA片段化和凋亡小体形成等。根据丝腺细胞在这一过程中发生基因组DNA片段化这一现象，将该过程中的丝腺组织分为三种类型：正常的、将要死亡的和已经死亡的细胞组织。 为了解哪些蛋白可能参与了丝腺组织的程序性细胞死亡，本研究采用了蛋白质组学的方法来分析该过程中丝腺组织蛋白的差异表达。经过蛋白质双向电泳分析，发现在电泳胶图上这三种样品均有近1000个可重复性的蛋白点，对图像的定量性分析发现程序性细胞死亡过程中有43个下调和34个上调的蛋白点。经过质谱分析，鉴定了其中的17个差异表达的蛋白点。这些蛋白既含有已经了解的凋亡相关蛋白，也有一些新发现的相关蛋白，如caspases，蛋白酶体亚基，延伸因子，热激蛋白，以及一些预测蛋白(hypothetical proteins)。 实验结果暗示了这些蛋白可能参与了家蚕丝腺组织的程序性细胞死亡过程，并从一个崭新的方面对这一机制进行了深入地探讨。从双向电泳及质谱分析得到的数据中，选择一些基因如Bm-caspase-1等，利用RNAi技术降低它们在家蚕化蛹过程中的表达量，验证这些蛋白在这一过程中发挥的作用，并希望从中发现能够延长家蚕化蛹时间的基因。 本研究发现，将合成的Bm-caspase-1基因双链RNA注射到熟蚕体内，导致在家蚕化蛹早期该基因的mRNA水平较对照组有所下调，并且丝腺细胞基因组DNA片段化的发生时间出现相应的推迟。这暗示了Bm-caspase-1基因在家蚕化蛹过程中，对丝腺细胞程序性死亡起到了促进的作用。 本研究工作对于了解化蛹过程丝腺组织萎缩、消失的机制提供了新的线索，进而为改良家蚕的经济性质，如延长丝腺组织的存活时间从而增加家蚕的吐丝时间等方面提供了一定的理论依据；同时还寻找到了一些与家蚕化蛹密切相关的基因，可以利用基因工程技术手段延长家蚕的蛹期时间，以便于鲜蛹的保存。 二、表达SARS病毒相关蛋白和葡激酶。 昆虫杆状病毒载体表达系统(Baculovirus expression vector system，BEVS)已被公认为当今基因工程四大表达系统之一。由于其高效的蛋白表达、较完善的翻译后修饰等特点，目前已成为生产和研究各种原核、真核蛋白的有效工具。然而该系统也存在有不能连续性表达重组蛋白、重组病毒同复突变及细胞培养要求苛刻、价格较高等缺陷。家蚕的丝腺在长期的选育驯化过程中，已经逐渐分化形成了强大的蛋白质合成生物反应器。为了弥补这一系统的缺陷，科研工作者们希望能利用转基因技术构建可遗传的转基因家蚕，开发高效表达外源蛋白的丝腺组织生物反应器，能够在真核细胞中连续性表达外源蛋白，同时也能很大程度上降低材料培养的要求和价格。 本论文建立了昆虫杆状病毒载体表达系统和转基因家蚕生物合成器这样两种蛋白表达系统，尝试表达了SARS病毒相关蛋白和葡激酶，并对它们的特性进行了初步的探索。利用杆状病毒表达系统，在昆虫细胞中表达了严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒SARS-CoV的结构蛋白：刺突蛋白(spike protein，S蛋白)的全长和膜外部分。同时，利用该系统，在昆虫细胞中表达了来源于金黄色葡萄球菌的葡激酶蛋白(Staphylokinase，SAK)，希望该蛋白潜在的修饰位点发生翻译后修饰作用，从而改变其免疫原性，为SAK在医药卫生工作中的应用提供理论基础。 本研究发现，两种昆虫细胞：Sf9和Tn细胞系均能够表达葡激酶蛋白，但没有明显的糖基化引起的分子量变化；本研究还利用piggybac转座子构建了丝素轻链启动子控制的葡激酶转基因家蚕，该启动子被认为具有丝腺组织表达的特异性。转基因家蚕能够稳定遗传葡激酶基因，但启动子的组织特异性不高，在非丝腺组织中有渗漏转录。免疫印迹未检测到SAK蛋白，转基因家蚕的生物发生器还需要进一步的优化。