芽胞杆菌(Bacillus)是一类好氧或兼性厌氧的革兰氏阳性细菌。其中作为模式菌株的枯草芽胞杆菌(B.subtilis)168和W168，在革兰氏阳性菌的各种生理、代谢和信号调控等机理研究中起了重要的作用。另外，由于其具有蛋白分泌能力强、发酵水平高、安全无毒、无污染等优良特性，在生物合成工业酶制剂、聚氨基酸、维生素、核苷及抗病毒类药物等方面得到了广泛应用。随着遗传学、分子生物学及代谢工程等学科的迅猛发展及相关研究的日趋深入，现有的芽胞杆菌操作系统由于存在重组频率低、操作周期长等缺点，只能通过耗时费力的载体构建进行单个基因的改造，无法实现染色体上多个靶基因的同时改造，已不能满足当今研究工作的需要。因此，建立与开发新型高效的枯草芽胞杆菌遗传操作系统具有极其重要的意义。　　本文以模式菌株枯草芽胞杆菌W168为研究对象，通过引入噬菌体重组酶，建立了一套以单链DNA(single-stranded DNA，ssDNA)为转化底物由噬菌体重组酶GP35介导的高效重组系统。另外，通过将不同长度、不同类型和不同功能的基因修饰片段在整合质粒上串联起来以提高转入到细胞内的有效DNA数量，并通过优化串联基因的数目和自然感受态转化的条件，实现了芽胞杆菌染色体上6个基因的同时修饰。以模式菌株枯草芽胞杆菌W168为研究对象，利用合成的oligo，实现了枯草芽胞杆菌染色体和胞内质粒携带基因的定点修饰。以合成的90 nt的oligo为转化底物，分别转化在染色体或质粒上引入无义突变的卡那霉素抗性（kanamycin，kan）基因的菌株BS151和WYB256，实现了染色体或质粒上kan基因的回复突变，使菌株BS151和WYB256恢复了卡那霉素抗性，重组频率分别为4.67±2.52×10-5和1.33±0.58×10-5;并实现了枯草芽胞杆菌染色体上编码RNA聚合酶β-亚基(Beta subunit of RNA polymerase)的rpoB基因的定点突变，重组频率为1.33±0.58×10-5。提高枯草芽胞杆菌的重组频率，从双链DNA(double-stranded DNA，dsDNA)、ssDNA、链偏向性和硫代修饰等几个方面探讨了8种外源DNA形式对其重组频率的影响。结果显示，以deoD-ssDNA(purine nucleoside phosphorylase)为转化底物时的重组频率明显高于以dsDNA为转化底物时的重组频率，并且以滞后链为靶标的ssDNA的重组频率显著高于以前导链为靶标的ssDNA的重组频率(2.87±0.86×10-3 VS0.93±0.28×10-3)。为减少胞内的核酸酶对ssDNA的降解作用，我们进一步对ssDNA末端进行了硫代修饰。当使用经硫代修饰的ssDNA作为转化底物时，枯草芽胞杆菌的重组频率比未经硫代修饰的ssDNA作为转化底物时提高了近3倍（8.41±0.95×10-3 VS2.87±0.86×10-3）。这些结果表明硫代修饰的以滞后链为靶标的ssDNA的重组效果明显优于其他形式的外源DNA。　　本研究引入噬菌体重组酶GP35提高枯草芽胞杆菌的重组频率。首先，我们分别从转录和翻译水平证明了GP35能够在枯草芽胞杆菌胞内表达;进一步通过重组实验首次证明了GP35在枯草芽胞杆菌胞内具有较高的重组活性。并在此基础上，建立了一套以ssDNA为转化底物，GP35介导的高效重组系统，其重组频率达到1.71±0.15×10-1，比文献的报道提高了102倍。为了进一步评估不同来源的噬菌体重组酶在枯草芽胞杆菌中的重组能力，我们选取了9种不同来源的噬菌体重组酶与GP35在相同体系下进行重组实验，结果表明GP35介导的deoD-ssDNA的重组频率最高，达到了1.71±0.15×10-1;来源于李斯特菌(Listeria monocytogenes)噬菌体A118的重组酶Orf48所介导的deoD-ssDNA与GP35的所介导的deoD-ssDNA的重组频率接近，为1.36±0.16×10-1。来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的GP20、乳酸菌(Lactococcus lactis)的Orf245和来源于分支杆菌(Mycobacterium smegmatis)噬菌体的GP61所介导的deoD-ssDNA的重组频率略低于GP35和Orf48的重组频率，分别达到了8.81±1.57×10-2、6.70±0.92×10-2和6.05±0.83×10-2。而其他几个重组酶如Beta、S065、RecT、Plu2935和OrfC所介导的deoD-ssDNA的的重组频率较低，分别达到了3.07±0.18×10-2、2.50±0.10×10-2、2.11±0.14×10-2、1.41±0.24×10-2和1.18±0.27×10-2。其中，GP35介导的deoD-ssDNA的重组频率比来源于大肠杆菌噬菌体重组酶Beta的重组频率提高了4.57倍。通过敲除comK(编码competence transcription factor)基因构建了一株自然感受态非常弱的菌株(BS161)，并以BS161为研究对象进行重组实验，获得很高的重组频率（1.5±0.06×10-1），同样在一株天然的自然感受态非常弱的枯草芽胞杆菌ATCC6633重复了上述重组实验，仍获得很高的重组频率。表明GP35介导的重组系统可在自然感受态缺失的枯草芽胞杆菌中推广应用。通过对不同来源重组酶噬菌体的宿主进行系统发育分析，发现来源于革兰氏阳性菌噬菌体的重组酶所介导的deoD-ssDNA的重组频率高于来源于革兰氏阴性菌噬菌体的重组酶，并且呈现一定的规律:与枯草芽胞杆菌亲缘关系越近，其重组酶的重组频率越高;反之，其重组频率越低。　　本研究构建了基于整合质粒上多基因串联的枯草芽胞杆菌多元重组系统。首先，为了提高枯草芽胞杆菌的自然转化效率，我们通过低拷贝表达质粒pHCMC02携带comK基因的方式在枯草芽胞杆菌W168中过表达comK基因。结果显示过表达comK基因的菌株WYB258比野生型W168菌株的转化效率提高了近22倍（2080.43±156.06 CFU/μg DNA VS95.63±10.15 CFU/μg DNA），表明过表达comK基因可大幅提高枯草芽胞杆菌的自然感受态能力。其次，为了提高单次转入枯草芽胞杆菌细胞内的有效DNA的数量，我们将不同长度、不同类型或不同功能的基因修饰片段在整合质粒上串联起来，使单次转化进入细胞内的有效DNA修饰片段的数量增多，进而提高共转化的效率。结果显示与其他形式的转化底物相比，当以不同修饰片段串联在一起的质粒为转化底物时，其共重组效率最高，达到了96.25±6.06 CFU/μg DNA。表明转化底物是影响基因组编辑效率的又一重要因素。为了研究质粒上所串联的基因修饰片段数量对染色体上同时发生修饰基因数的影响，我们分别构建了两个质粒，pWYE792（质粒上串联了6个不同的基因修饰片段）和pWYE830（质粒上串联了10个不同的基因修饰片段）。当以pWYE792为转化底物时，转化过表达comK基因的菌株WYB258，最多只能实现4个基因的同时修饰。但当将串联的修饰片段增加到10个的时候（即以pWYE830为转化底物），单次转化获得了两个不同基因型的六重突变株，实现了染色体上6个基因的同时修饰。表明整合质粒上串联的基因修饰片段数量与染色体同时发生修饰的基因数目之间存在相关性。建立的噬菌体重组系统为芽胞杆菌属的其它细菌进行遗传操作提供了一套高效的工具，对基因工程菌的构建和生理生化的研究具有重要的意义;重组酶活性与其宿主亲缘关系的结果也为其他细菌进行遗传改造选择合适的重组酶提供了理论指导。此外，我们建立的多元重组工程突破了以往单次转化基因编辑数量受到限制的问题，利用简单的质粒构建实现了单次转化多个靶基因的快速高效的同时编辑，为芽胞杆菌及革兰氏阳性细菌新型遗传操作系统的建立提供科学依据和实践基础。