目前，不孕不育人群的数量正在逐年增加，已经对我国人民的生殖健康产生严重影响。造成不孕不育的重要原因之一是卵巢发育不良，患者数量也逐渐增加，而且发病年龄越来越年轻。卵巢的发育主要是卵泡的发育，其发育过程经历原始卵泡，初级卵泡，次级卵泡，成熟卵泡等阶段，在生长发育过程中大部分卵泡发生闭锁，只有一少部分卵泡能发育为成熟卵泡并排卵。卵巢的发育主要受下丘脑-垂体-卵巢轴和卵巢内相关因子的调控。晶体蛋白由α族晶状体蛋白、β族晶状体蛋白、γ族晶状体蛋白三大类组成，是哺乳动物眼睛晶状体的重要组成成分，对维持晶状体透明性和屈光度起着至关重要的作用。βB2晶体蛋白，是组成β族晶体蛋白的主要部分。最近几年，越来越多的研究者开始关注βB2晶体蛋白在晶状体外的作用，特别对生殖功能的影响。有研究表明βB2晶体蛋白在睾丸内表达并影响睾丸的生殖功能，但是其对卵巢的结构及功能的影响少有报道。我们课题组前期研究发现βB2晶体蛋白（Crybb2）基因敲除（Crybb2-/-）会影响雄性小鼠睾丸的发育，导致生殖能力下降。由此引出的问题是：该蛋白是否对雌性小鼠的生殖功能也产生一定影响？是否会影响到雌性小鼠的卵巢发育？又是通过何种途径影响卵巢发育？此即为本课题的研究目的。本课题组具有βB2晶体蛋白基因敲除小鼠模型，这将为研究因βB2晶体蛋白基因缺失而引起的生殖功能改变提供良好的基础。本课题将在前期研究基础上，观察βB2晶体蛋白对雌性小鼠卵巢发育的影响，并进一步探讨βB2晶体蛋白对雌性小鼠生殖能力的作用机制，以期对临床上不孕不育发病机制的研究提供新的思路。研究目的：观察Crybb2-/-雌性小鼠动情周期和生殖能力的变化，研究βB2晶体蛋白对雌性小鼠卵巢结构和功能的影响，找出βB2晶体蛋白在卵巢的细胞定位，并初步探讨其在该细胞中调控雌性小鼠卵巢发育和生殖功能的机制，以期对临床上不孕不育症的发病机制的研究提供新的思路。研究方法：1. Crybb2-/-雌性小鼠生殖力改变发育成熟的同龄WT和Crybb2-/-雌性小鼠分别与WT雄性小鼠杂交并观察五个月，记录总生殖窝数、总仔数、窝产仔数及每只雌鼠产窝数。2. Crybb2-/-小鼠动情周期的改变选取同龄性成熟WT和Crybb2-/-雌性小鼠，阴道涂片方法确定动情周期，观察21天，记录各期（动情前期、动情期、动情后期、间情期）所占百分比。3.观察Crybb2-/-对雌性小鼠卵巢结构及功能的影响测量同龄WT和Crybb2-/-小鼠卵巢重量及大小，HE染色观察卵巢结构变化及各级卵泡数目的改变来明确Crybb2-/-小鼠卵巢结构的改变；并通过用化学发光法测定两组小鼠激素分泌功能的改变来验证βB2晶体蛋白对小鼠卵巢功能的影响。4.验证βB2晶体蛋白在小鼠卵巢组织内的表达用免疫印迹的方法验证βB2晶体蛋白在WT小鼠的卵巢内表达，而在Crybb2-/-小鼠的卵巢内未见表达；然后使用免疫荧光化学染色的方法验证βB2晶体蛋白在WT小鼠卵巢细胞内的定位。5.颗粒细胞增殖和凋亡检测采用流式细胞术检测WT和Crybb2-/-小鼠颗粒细胞凋亡和周期的改变，并采用Realtime PCR方法检测凋亡相关基因（bcl-2）及周期相关基因（cyclinD2、cdk4）水平的改变。6．雌激素受体mRNA水平的检测采用Real time PCR方法检测ERα和ERβ在WT和Crybb2-/-小鼠颗粒细胞内表达量的改变情况。实验结果：1．Crybb2-/-对雌性小鼠生殖功能的影响相同生产周期内，相对正常野生型配对小鼠，与Crybb2-/-雌鼠配对组总生殖窝数、总仔数、窝产仔数及每只雌鼠产窝数均减少。2．Crybb2-/-小鼠动情周期的改变Crybb2-/-小鼠21天内的动情周期循环数显著低于WT小鼠，但是动情期所占百分比显著低于WT小鼠，间情期显著高于WT小鼠，动情前期和动情后期无统计学差异。3. βB2晶体蛋白基因敲除对雌性小鼠卵巢结构及功能的影响相比同龄同体重的WT小鼠，Crybb2-/-小鼠卵巢重量及大小均明显降低。HE染色结果：与WT小鼠相比，Crybb2-/-小鼠卵巢内成熟卵泡数量较少，未见明显黄体，闭锁卵泡增多，新形成的卵泡数量极少。且Crybb2-/-小鼠卵巢原始卵泡、次级卵泡与成熟卵泡数量明显减少，说明Crybb2-/-小鼠的卵巢发育不良。Crybb2-/-小鼠雌二醇在动情后期及间情期分泌显著高于WT小鼠，孕酮在间情期分泌低于WT小鼠，但是雄激素分泌正常。4．βB2晶体蛋白在卵巢组织中的表达免疫印迹方法检测βB2晶体蛋白在WT小鼠卵巢组织内表达，而在Crybb2-/-小鼠卵巢内不表达；免疫荧光细胞化学染色结果证实βB2晶体蛋白表达在小鼠卵巢组织颗粒细胞胞浆内。5．卵巢颗粒细胞增殖、凋亡改变流式细胞仪周期检测结果显示，相对正常小鼠，Crybb2-/-小鼠的颗粒细胞G0/G1期所占的百分比大于WT小鼠，S期所占百分比小于WT小鼠，G2/M期所占百分比小于WT小鼠。卵巢颗粒细胞凋亡，Crybb2-/-小鼠卵巢颗粒细胞早期凋亡比率明显增多。RT-PCR结果，Crybb2-/-小鼠颗粒细胞内bcl-2、cyclinD2、cdk4mRNA水平明显降低。6．雌激素受体mRNA水平的检测RT-PCR结果显示，雌激素受体ERα mRNA水平表达下降，但ERβ mRNA水平没有统计学差异。实验结论：1． βB2晶体蛋白基因敲除后雌性小鼠生殖能力明显减弱。2． βB2晶体蛋白基因敲除后雌性小鼠动情周期紊乱，动情期比率减少及动情周期次数的减少，会影响到雌雄小鼠的交配，从而降低受孕率。3． βB2晶体蛋白基因敲除小鼠卵巢发育不良，各级卵泡数目减少，从而使排卵减少，影响生殖；雌激素和孕激素分泌紊乱，影响卵巢功能。4． βB2晶体蛋白在卵巢颗粒细胞胞浆中表达，并通过一定途径作用于凋亡、增殖及激素分泌相关基因，从而引起颗粒细胞凋亡、增殖及激素分泌的改变，使卵巢相应结构及功能受损，从而影响生殖。