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背景:作为威胁我国妇女生命健康的主要恶性肿瘤之一,乳腺癌在女性癌症发病率排名第一,死亡率居于第二位。近年来其发病率呈现上升趋势、年轻化趋势明显,其病因复杂,与遗传、生殖、营养、环境等密切相关,严重危害着广大女性同胞的身心健康。随着人们越来越意识到乳腺癌,越来越多的患者被治愈或延长了生命。对于人类而言,重要的是找到导致乳腺癌侵袭和转移的关键分子,找到新的诊断指标和治疗目标,探讨乳腺癌侵袭转移的可能机制,对减少乳腺癌的复发转移,改善乳腺癌诊疗效果、提高患者生存率、降低肿瘤相关病死率具有十分重要的临床指导意义。长链非编码RNA(Longnon-codingRNA,lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸但却不编码蛋白质的RNA,在过去一直被认为是转录过程中的“噪音”,并不具备生物学功能。然而近年的研究显示:lncRNA参与许多重要的调控过程,如染色质修饰、组蛋白修饰、基因组印记和转录激活。在表观遗传,转录和转录后水平以RNA的形式与其他非编码RNA(ncRNA)、蛋白质和基因组DNA进行通信,参与多种肿瘤的进程。其中,lncRNA较为引人瞩目是作为内源性竞争。性RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)中的一份子,lncRNA通过各种机制广泛参与基因表达后调控,作用于各种细胞组织并发挥其生物学功能,如影响细胞增殖,转移,凋亡和致癌作用。它在基因调控和其他方面起着非常重要的作用。基因间长链非编码 RNA 00654(long intergenic non-coding RNA,LINC00654),又被称为非编码 RNA LOC149837(non-coding RNA,LOC149837),可以作为致癌基因在多种癌症中发挥作用。我们通过PUBMED数据库了解到LINC00654是与乳腺癌密切相关的基因,位于染色体20p12.3。然而,其在乳腺癌当中的临床意义和生物学功能仍然是未知的。本研究旨在检测LINC00654在乳腺癌中的相对表达量及其与临床病理特征之间的相关性,以揭示其在乳腺癌的发生发展中的生物学作用。本研究通过对乳腺癌中LINC00654的相对表达量的检测以及其在体外研究中对乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭等生物学功能的的验证,提示LINC00654作为促癌基因,能够参与乳腺癌的进程进展。因此LINC00654可以视为未来乳腺癌的潜在分子靶点,为进一步研究乳腺癌中的LncRNA提供了方向。第一部分LINC00654在乳腺癌组织、癌旁组织、五种乳腺癌细胞株和一种正常乳腺细胞株中的表达。目的:检测乳腺癌组织及其癌旁组织中LINC00654基因的相对表达量,以及在五种乳腺癌细胞和一种正常乳腺细胞株中LINC00654基因的相对表达量,初步确定LINC00654在乳腺癌中的表达量。同时分析LINC00654在乳腺癌中的的表达与乳腺癌临床病理资料之间的关系,明确LINC00654在乳腺癌中发挥的作用。方法:收集105对乳腺癌组织及其相应的癌旁组织的新鲜标本,通过实时荧光定量 PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)检测 LINC00654在105对乳腺癌组织及其癌旁组织中的相对表达量。然后用qRT-PCR检测其在正常乳腺上皮细胞株MCF-10A,五种乳腺癌细胞株(MCF-7、MDA-MB-231、SKBR-3、BT-474、MDA-MB-453)中的相对表达量。最后分析LINC00654基因在乳腺癌中的表达水平与相应临床病理资料之间的联系,并对两者之间进行相关性分析。结果:(1)LINC00654在乳腺癌组织及其癌旁组织中的表达通过qRT-PCR检测LINC00654在乳腺癌组织及其癌旁组织(105例)内的表达水平,研究结果显示:相比于癌旁组织(1.0079±0.3004),LINC00654基因能够高表达于乳腺癌组织(1.9793±1.7317)内,比较结果具有显著性差异(t=5.664,p<0.0001)。(2)LINC00654在五种乳腺癌细胞株和正常乳腺细胞株中的表达通过qRT-PCR检测,将正常乳腺癌上皮细胞株MCF-10A作为对照,LINC00654在五种乳腺癌细胞株中的表达分别为:MCF-7(1.5186±0.26369)、MDA-MB-23 1(1.6539±0.83683)、SKBR-3(2.8955±0.41610)、BT-474(2.4939±0.46187)、MDA-MB-453(2.0229±0.76605),均高于正常细胞株 MCF-10A(1.001±0.0371)中的表达,差异具有统计学意义(p均<0.05),其中,MCF-7乳腺癌细胞株在五种乳腺癌细胞株中相对表达最低,SKBR-3乳腺癌细胞株在五种乳腺癌细胞株中表达相对表达最高。(3)LINC00654的表达与患者临床病理资料的关系结合105位乳腺癌患者的临床病理资料,分析比较LINC00654在乳腺癌中的高表达和低表达,与患者临床病理资料之间的关系,如年龄、性别、TNM分期、病理分级、淋巴结转移(lymph node metastases,LNM)、远处转移(Distant metastases,DM)、肿瘤大小等。数据分析提示:LINC00654的表达与乳腺癌患者的年龄(p=0.0029)、淋巴结转移(p=0.0188)、体质量指数(P=0.0287)、HER2阳性(p=0.0447)密切相关,差异具有统计学意义。结论:1、与癌旁组织相比较,LINC00654mRNA在乳腺癌组织中的表达量更高。2、与正常乳腺细胞株MCF-10A相比较,LINC00654 mRNA在五种乳腺癌细胞株(MCF-7、MDA-MB-231、SKBR-3、BT-474、MDA-MB-453)中的表达量更高。3、LINC00654 mRNA在乳腺癌组织中的表达情况与患者的年龄、淋巴结转移、体质量指数和HER2阳性具有相关性。第二部分LINC00654对乳腺癌细胞株MCF-7和SKBR-3增殖、迁移和侵袭的影响目的:检测LINC00654对乳腺癌细胞株MCF-7和SKBR-3恶性生物学功能的影响。方法:构建过表达LINC00654质粒和对照组空白质粒,使用过表达LINC00654质粒和对照组空白质粒分别瞬时转染乳腺癌细胞株MCF-7和SKBR-3两种乳腺癌细胞株,运用CCK-8检测LINC00654对MCF-7和SKBR-3细胞株增殖的影响;划痕试验检测LINC00654对MCF-7和SKBR-3细胞株迁移能力的影响,Transwell检测LINC00654对MCF-7和SKBR-3细胞株迁移和侵袭能力的影响。进一步阐述LINC00654在对乳腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力的作用结果:(1)通过过表达质粒载体将LINC00654基因转染到MCF-7和SKBR-3细胞中,并通过qRT-PCR检测其转染效率。在MCF-7细胞株中,相对于阴性对照组(NC组),细胞株MCF-7 LINC00654过表达组的细胞的LINC00654 mRNA表达水平明显增高(p<0.0001),而和control组未见明显改变(p>0.05)。在SKBR-3细胞株中,相对于NC组,细胞株SKBR-3 LINC00654过表达组的细胞的LINC00654 mRNA表达水平明显增高(p<0.0001),而control组未见明显改变(p>0.05)。结果提示转染效果显著,转染后的细胞可用于后续实验。(2)CCK-8实验检测转染过表达LINC00654质粒后的MCF-7和SKBR-3细胞,检测两者的增殖能力,在酶标仪于波长450nm的波长下检测各孔的光的吸收率变化倍数随时间变化。结果显示:结果显示:MCF-7细胞LINC00654过表达组生长较NC组和control组有增加;在24小时时,LINC00654 过表达组增殖率为 0.2420±0.0115,NC 组为 0.2313±0.0188,control组为0.1657±0.0150,三组细胞之间没有显着差异,在48小时时,LINC00654 过表达组增殖率为 0.6553±0.0379,NC 组为 0.5 717±0.0038)control组为0.5687±0.0081,三组细胞之间没有很显着的差异,但在72小时,将LINC00654过表达组(1.0687±0.0345)与NC组(0.7460±0.0381)和control组(0.8100±0.0100)进行比较,MCF-7细胞生长加快,增殖能力上升(P<0.001)。差异具有统计学意义。在我们所检测时间内,96 h时,LINC00654过表达组增殖率为 1.5770±0.0242,NC 组为 1.0467±0.0188,control 组为1.0910±0.0086,该组细胞的生长达到了最大生长(p<0.001),具有时间依赖性。差异具有统计学意义。SKBR-3细胞24h时,LINC00654过表达组(0.1955±0.0032)细胞生长较 NC 组(0.1626±.0382)和 control 组(0.1666±0.0049)无明显差异。在生长至48h时,LINC00654过表达组增殖率为 0.9703±0.0335,NC 组为 0.7853±0.0025,control 组为 0.7797±0.0170,此时三组细胞间就开始表现出差异,但差异不显著。但从72 h开始,过表达 LINC00654 组(1.8777±0.0106)细胞相对于 NC 组(1.2370±0.0148)和control组(1.3690±0.0546),SKBR-3细胞的生长受到促进,增殖能力明,显加强(p<0.001),差异具有统计学意义。在我们所检测的时间内,96 h时,LINC00654 过表达组增殖率为 1.9477±0.0196,NC 组为 1.6950±0.0072,control组为1.6163±0.0138,该组细胞的生长达到最大促进(p<0.001),具有时间依赖性,差异具有统计学意义。(3)划痕实验结果显示:过表达LINC00654质粒转染MCF-7和SKBR-3细胞后,对其进行划痕处理,并于划痕处理后Oh、8h、12h、24h对细胞进行拍照,计算各组各个时间点的迁移能力(迁移率=(拍照观察时间点划痕区域的面积-“Oh”划痕区域的面积)/“Oh”划痕区域的面积)。结果显示:8h时,MCF-7细胞中过表达LINC00654组的迁移率为0.4176±0.0121,NC组的迁移率为0.1846±0.0041,空白组的迁移率为0.1779±0.0017。12h时,过表达LINC00654 组迁移率为 0.5733±0.0041,NC 组的迁移率为 0.4616±0.0077,空白组的迁移率为0.4482±0.0131。24h时,过表达LINC00654组迁移率为0.9056±0.0237,NC组的迁移率为0.4483±0.0131,空白组的迁移率为0.6424±0.01322。差异具有统计学意义(p均<0.0001)。8h 时,SKBR-3细胞中过表达LINC00654组的迁移率为0.2241±0.01283,NC组的迁移率为0.2098±0.0079,空白组的迁移率为 0.2226±0.0094。12h时,过表达LINC00654 组迁移率为 0.4394±0.0159,NC 组的迁移率为 0.3174±0.00531,空白组的迁移率为0.3175±0.0058。24h时,过表达LINC00654组迁移率为0.9748±0.0110,NC组的迁移率为0.6805±0.0062,空白组的迁移率为0.5155±0.0666。差异具有统计学意义(p均<0.0001)。(4)Transwell实验结果:Transwell迁移实验结果显示:在MCF-7细胞株中,MCF-7细胞中过表达LINC00654组的细胞穿膜率有增加。在200×倍显微镜视野下观察发现,发现与通过NC组的细胞(35.8±2.8636)相比,转染过表达LINC00654质粒的LINC00654过表达组细胞迁移数量明显增加(13.40±1.673个),差异具有统计学意义(p<0.0001)。而NC组穿过的细胞数相对于control组穿过的细胞数(5.400±0.5099个),无明显差异,差异无统计学意义(p=0.7599)。在SKBR-3细胞株中,SKBR-3细胞转染质粒LINC00654后,SKBR-3细胞中过表达LINC00654组的细胞穿膜率同样有增加。在200×倍显微镜视野下观察发现,与通过NC组的细胞(35.8±2.8636)相比,转染LINC00654过表达质粒的LINC00654过表达组细胞迁移数量明显增加(58.2±3.2711个),差异具有统计学意义(p<0.0001)。而NC组穿过的细胞数相对于control组穿过的细胞数(33.40 ± 0.5099个)无明显差异,差异无统计学意义(p=0.1198)。侵袭实验结果显示:在MCF-7细胞株中,MCF-7细胞转染过表达LINC00654质粒后,MCF-7细胞中过表达LINC00654组的细胞穿膜率是增加的;LINC00654对乳腺癌细胞侵袭能力具有促进作用。在200×倍显微镜视野下,NC组穿过的细胞为(2.2±0.837)个,而转染LINC00654过表达质粒的LINC00654过表达组细胞穿过的数量明显减少,为(10.2±1.0954)个,差异具有统计学意义(p<0.001)。而NC组穿过的细胞数相对于control组穿过的细胞数无明显差异。在SKBR-3细胞株中,SKBR-3细胞转染过表达LINC00654质粒后,SKBR-3细胞中过表达LINC00654组的细胞穿膜率同样有增加;LINC00654对乳腺癌细胞侵袭能力具有促进作用。在200×倍显微镜视野下,NC组穿过的细胞为(33.6±3.1305)个,而转染LINC00654过表达质粒的LINC00654过表达组细胞穿过的数量明显减少,为(51.8±1.6431)个,差异具有统计学意义(p<0.001)。而NC组穿过的细胞数相对于control组穿过的细胞数无明显差异。结论:过表达LINC00654 mRNA能够增强乳腺癌细胞株MCF-7和SKBR-3增殖、迁移和侵袭的能力。