附睾作为羊膜动物雄性生殖系统中重要的器官，为精子的成熟、保护、运输和储存提供了特殊的微环境，在生殖过程中起着关键作用。随着生殖生物学的不断发展，近些年对于附睾的研究逐渐成为热点，然而，目前的研究主要集中在哺乳动物，有关其他脊椎动物附睾的研究鲜有报道。　　爬行动物是第一批真正摆脱对水依赖而登陆的脊椎动物，也是最早的羊膜动物，在动物进化史上占据十分重要的地位。爬行动物由于其变温和冬眠的特殊生理适应性，在进化过程中形成了许多不同于其它脊椎动物的生命现象，生殖道内长期的精子储存就是其中之一。与输卵管不同，爬行动物的附睾不仅可以长期储存精子，还是精子成熟的主要场所。然而，至今关于爬行动物附睾的研究大多见于有鳞目，且主要集中形态学方面，较深入的研究极少。中华鳖是爬行纲龟鳖目的代表物种之一，具有典型的冬眠特性和精子储存现象，在我国分布极广，是研究爬行动物附睾生物学特性的理想模式动物。本文首先对中华鳖附睾的组织结构和附睾内精子的形态特征进行了观察，进而对附睾内离子、雌激素受体α（ERα）和超氧化物歧化酶在生殖周期内的变化规律进行了研究。研究结果将从细胞和分子水平阐明中华鳖附睾微环境与精子生物学特性的关系，以期为中华鳖的人工繁殖，种群保护和精子液态储存提供可行性依据。　　试验一中华鳖附睾的微细结构与细胞组成　　应用光镜和透射电镜技术观察中华鳖附睾的组织结构特征及其季节性变化规律。中华鳖附睾按其解剖学特征，大致可分为头部、体部和尾部三部分。体视显微镜下可见22-28条输出小管出睾丸网后与附睾管相连。输出小管上皮主要由无纤毛细胞组成，其间夹杂着少量的纤毛细胞。生殖期与冬眠期相比，附睾上皮的高度存在显著性变化。附睾上皮由主细胞、亮细胞、顶细胞、狭窄细胞和基细胞五种类型组成。主细胞数目最多，与基细胞一起广泛存在于附睾各段。透射电镜下可见主细胞兼有分泌和吸收两种功能。狭窄细胞和顶细胞的数目极少，且仅见于附睾头部。亮细胞胞质较淡，电子密度低，位于附睾体部和尾部，与上述细胞不同，该细胞PAS反应呈强阳性，也具备分泌功能，分泌方式为全浆分泌。附睾腔内精子储存现象全年可见。电镜下，除大多数成熟的精子外，一部分携带胞质小叶的未成熟精子也被发现。此外，精子还与附睾上皮相互作用，一方面附睾腔内精子插入上皮分泌物内，另一方面，精子还插入到上皮细胞间隙内。附睾小体样膜泡首次被发现，其可结合到成熟精子和未成熟精子的膜表面，很可能参与精子的成熟。中华鳖附睾的结构与其它爬行动物差异明显;精子与附睾上皮相互作用以及附睾小体样膜泡的发现，表明中华鳖附睾不是单纯的精子储存器官，也可为精子的成熟提供必要的物质基础。　　试验二中华鳖附睾内精子形成　　应用光镜和电镜技术观察了冬眠期中华鳖附睾内精子显微和超微结构变化。光镜下可见，精子排放（12月份初）时，少量的精细胞和正在变态过程中的精子被一起从睾丸排出，进入睾丸网和输出小管内。在附睾各段管腔内均可观察到变态发育的精子细胞，电镜结果表明其变态过程具有连续性。12月扫描电镜可见，附睾头部管腔内包含一定数量的圆球形或椭圆形的精子细胞。有些细胞表面开始出现凹窝或隆起。运输到附睾体部的精子细胞已获得一定的发育，其鞭毛突出并缠绕在精子细胞表面，同时，精子细胞内多余的细胞质逐渐被消除，精子细胞体积显著变小;随着多余胞质小叶的排除，精子形态趋于成熟。在精细胞内部，细胞核的变化主要表现在胞核的拉长变形和染色质的浓缩两个方面，且两者同步进行。透射电镜下可见，染色质由早期松散淡染的细小颗粒逐渐融合成粗大致密的颗粒，颗粒之间有细丝相连;随着染色质颗粒不断地相互融合，颗粒间隙逐渐消失，最终细胞核浓缩成致密均质状。精子涂片显示，变态精子细胞的比例随储存时间的延长而降低。冬眠初期（12月份）附睾头部、体部和尾部处于变态过程中的精子分别为11.4％，7.8％和3.7％，而到了冬眠末期（3月份）其比例下降到2.6％，3.2％和1.6％。流式细胞结果显示95％以上的精子具有活性，且在储存期各月间各段内活精子数目差异不显著(P＞0.05)。基于以上发现，我们推测精子形成（至少从细胞核浓缩开始）可在附睾内完成。与传统的、必须在支持细胞协助下完成的精子形成相比，游离精子细胞在附睾内的变态发育过程，其表面和空间结构变化易于观察和研究，因此，中华鳖附睾或许可以成为研究精子形成的独特的模型。　　试验三生殖期中华鳖附睾尾部精子超微结构　　应用透射电镜和扫描电镜技术研究了生殖期（5-8月）中华鳖附睾尾部精子的超微结构特征。成熟精子体态细长，呈蚯蚓状，总体上可分为头部和尾部两部分，尾部又可分为中段、主段和末段。与许多鸟类、两栖类以及其他爬行动物精子的形态类似。但也存在一些独特性：　　(1)2-3条核内小管穿过顶体下锥，进入核前突，止于核体部;　　(2)中段由中央的中心粒和周围的线粒体鞘组成。线粒体鞘由8圈线粒体环形排列而成，每圈5个线粒体，相邻层的线粒体错位1/2排列;　　(3)线粒体呈球状，中央为一致密的核心，外周由8-10层同心圆状排列的双层膜构成。　　除成熟精子外，还观察到21.4±3.6％形态尚未成熟的精子。与成熟精子不同，扫描电镜显示未成熟精子仍被一定量的细胞质滴附着，少量的未成熟精子的尾部缠绕在较大的细胞质滴周围而未伸展开。透射电镜下可见大量的细胞质附着于精子表面，被外面的细胞膜包裹，甚至在细胞质中仍然存在游离的线粒体和高电子密度物质。大多数未成熟精子已展开，仅存在少量的细胞质滴附着于精子头部后端和中段的连接处，细胞质滴主要由小膜泡和脂滴组成。脂滴常位于线粒体周围，可能与线粒体的形态发生或退化有关。附睾尾部的未成熟精子活力正常，但能否正常受精尚不可知。生殖期附睾尾部未成熟精子的存在，表明尾部或也参与精子成熟作用。　　试验四中华鳖附睾液中5种金属离子含量与精子活力相关性分析　　为了研究中华鳖附睾内微量元素含量与其精子活力之间的关系，本试验采用电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES)测定了中华鳖冬眠期和生殖期内各段附睾液中Ca2+、Mg2+，Zn2+、Cu2+、Fe2+等5种金属离子的含量，利用计算机辅助精子分析仪(CASA)测定了生殖周期内附睾各段精子的活力，并对二者进行了相关性分析。结果表明:精子活力与附睾液中Zn+、Ca2+极显著相关，与Mg2+显著相关，而与Fe2+和Cu2+相关性不大，表明中华鳖附睾内Zn2+、Ca2+和Mg2+在调节其精子活力方面发挥了重要的作用，可能是精子在附睾环境内能够长期储存的重要因素。　　试验五中华鳖附睾内ERα的季节性表达与分布　　生殖周期内，从中华鳖附睾各段组织中提取总RNA，通过RT-PCR扩增出ERα基因的cDNA，目的条带测序验证后，采用半定量RT-PCR方法研究ERα基因在附睾各段组织内的表达。并采用免疫组织化学方法研究了雌激素受体α在中华鳖附睾各段组织中的分布定位，以探讨ERα在附睾内的变化规律和作用。结果显示，生殖期（6、8月份），附睾各段组织中ERαmRNA表达水平依次为，附睾头部＞体部＞尾部;而冬眠期（12、2月份）ERmRNA表达水平与生殖期相反，即:附睾尾部＞体部＞头部。免疫组织化学结果与基因表达水平基本一致;阳性反应主要见于输出小管和附睾管上皮细胞的胞核，输出小管中纤毛细胞较非纤毛细胞阳性反应强烈;附睾上皮ERα阳性反应主要见于主细胞和基细胞;胞质及附睾管腔内也可见一定程度的阳性反应。ERα在附睾各段内表达呈季节性变化，表明它可能与精子在附睾内成熟和储存有密切的关系。　　试验六中华鳖附睾内超氧化物歧化酶(SOD)活力的季节性变化　　为研究生殖周期内中华鳖附睾超氧化物歧化酶(SOD)的变化，利用SOD活力测定试剂盒，分别测定了生殖期（6月和8月）和冬眠期（12月和2月）附睾各段组织及管腔液内SOD的活力。结果显示，在整个生殖周期内，各段附睾液中SOD活力差异较大，且同一部位附睾液内SOD的活力生殖期高于冬眠期。生殖期内，尾部的附睾液SOD活力最高，为1518.53±124.88U/mL,与头部和体部差异显著（P＜0.05）。冬眠期内，头部附睾液SOD活力最高，为508.45±45.40U/mL，与体部与尾部差异显著（P＜0.05）。生殖期附睾尾部组织中SOD的活力最高，为137.58±14.81U/mgprot，与附睾体部差异显著(P＜0.05)，与附睾头部差异未达到显著水平(P＞0.05)。冬眠期附睾组织中SOD的活力低于生殖期，且各段之间SOD的活力差异不显著（P＞0.05）。附睾中SOD活力呈季节性变化，表明它可能与精子在附睾内运动和储存具有一定的相关性。　　试验七中华鳖SOD家族的基因克隆、原核表达、多抗制备及其在附睾内的表达　　(Ⅰ)中华鳖附睾SOD家族的基因克隆与分析根据物种间序列的保守性，设计简并引物，采用RT-PCR方法于中华鳖附睾组织中克隆SOD家族中的Cu/Zn-SOD和Mn-SOD基因片段。PCR产物回收纯化后连接pEASY-T1载体，转化入大肠杆菌，对阳性克隆测序。测得Cu/Zn-SOD和Mn-SOD基因片段分别长279bp和486bp，提交GeneBank后获得两个登录号，分别为JN084035和JN159970。将推导的氨基酸序列与其他物种进行比对，结果显示中华鳖的Cu/Zn-SOD基因和氨基酸序列均与乌龟和人的同源性较高;而Mn-SOD基因与氨基酸序列与蜥蜴和鸡的同源性高。二者与金属离子结合的位点高度保守，未发生变异。　　(Ⅱ)Cu/Zn-SOD的原棱表达、多抗制备及在附睾液内的表达Cu/Zn-SOD是超氧化物歧化酶(SOD)家族中的重要成员之一，在机体抗氧化过程中发挥着重要的作用。为获得中华鳖Cu/Zn-SOD的多克隆抗体，用以研究其在中华鳖附睾各段管腔液中的表达情况;上一节中已获得的中华鳖Cu/Zn-SOD基因片段为模板，设计引物加入酶切位点，进行PCR扩增。PCR产物和原核表达载体pColdI经限制性内切酶NdeI、XhoI消化后，连接，构建表达质粒pColdI-Cu/Zn-SOD。在异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）的诱导下，实现了Cu/Zn-SOD的有效表达。SDS-PAGE结果显示，重组表达质粒转化BL21后经IPTG诱导，在破碎菌液上清中获得大小13kd左右的的重组蛋白。重组蛋白经Ni2+亲和层析柱和分子筛纯化后免疫兔子制备多抗，三免后采血并分离出血清即为抗血清。间接Elisa测得多抗效价在1∶64000以上，Western blot显示抗体特异性良好。制备的抗体用于中华鳖附睾液内Cu/Zn-SOD的表达检测。Western blot结果表明，生殖期内附睾尾部管腔液中Cu/Zn-SOD高表达，约为附睾头部和体部Cu/Zn-SOD的两倍以上;而冬眠期内附睾各段管腔液中Cu/Zn-SO表达略有下降，附睾体部和尾部表达水平相当，但均低于附睾头部的表达量。Cu/Zn-SOD可由附睾上皮细胞分泌进入管腔，其在附睾各段管腔内的季节性表达，可能与精子储存有重要关联。