H6亚型禽流感病毒病原学监测和快速诊断方法的研究

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H6亚型禽流感病毒(AIV)属于低致病性A型流感病毒,水禽和野鸟是H6亚型禽流感病毒的主要宿主。H6亚型禽流感病毒可以感染哺乳动物,如鼠和水貂,甚至还有报道称在健康的青年体内检测到了H6亚型AIV的抗体。低致病性AIV通过基因重排等为H5N1等高致病性禽流感病毒提供基因,从而可能引起流感的流行。   从2009年至2011年活禽市场采集样品中分离H6亚型禽流感病毒。用血凝抑制试验初步筛选,PCR方法进行进一步的确认检测,对NA基因进行序列测定。结果表明,2009年到2011年间的样品中共分离到7株H6亚型禽流感病毒,分别为1株H6N1,两株H6N2,一株H6N5,两株H6N6,一株H6N8。   对分离到的7株鸭源H6亚型禽流感病毒的八个基因片段进行序列测定。完成7株H6亚型AIV的全基因测序后,将序列鉴定结果与GENBANK上的序列进行比对分析。结果表明,7株H6亚型AIV的八个基因片段均属于欧亚谱系,基因来源结构比较复杂。在HA1和HA2剪切位点,7株分离株的氨基酸序列为P-Q-I-E-T-R-G,仅含一个碱性氨基酸,都符合典型低致病性禽流感病毒特征序列。   建立了检测H6亚型禽流感病毒(AIV)逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法,对反应条件和反应体系进行优化。结果表明该方法的特异性良好,对其他呼吸道病原体均无扩增反应。该方法灵敏度高,最低可检测到H6亚型AIV RNA为0.01pg,该方法无需特殊仪器,只需在水浴锅中进行,是一种适于基层的简便、灵敏、快速的H6亚型AIV检测方法。并且建立了H6亚型禽流感病毒(AIV)SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明,该方法的最低检测限为1.07×101拷贝质粒DNA,比RT-PCR灵敏度高出1000倍。对其他呼吸道病原体无扩增;检测快速,从样本处理到报告结果仅需3.5h。   比较对H6亚型AIV建立的四种快速检测方法RT-PCR、巢式RT-PCR、实时荧光定量PCR和RT-LAMP四种方法的灵敏性。结果表明:四种方法中,实时荧光定量PCR的敏感性最高,其次为RT-L AMP和巢式RT-PCR,普通PCR敏感性最低。基层检验时可以根据需要和条件选择适合的检测方法,多种快速检测方法结合可以更好地确定诊断。
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