背景：骨关节炎(Osteoarthritis,OA)的主要病理机制是软骨细胞外基质.软骨组织的丢失和异常的重塑。软骨细胞是成熟软骨组织内唯一的细胞类型,具有分泌细胞外基质(Ⅱ型胶原、蛋白聚糖等)以及在某些细胞因子的作用下表达炎症因子的功能,因此在软骨损伤以及重塑过程中起到维持组织内环境稳定的作用。有关的文献表明由于软骨组织缺乏自身修复和清除机制,软骨组织工程在软骨修复、重建中将起到重要的作用,但临床上软骨细胞来源的缺乏的难题以及关于组织工程软骨组织在炎性环境下的评估文章鲜有报道。本研究首先将有限的软骨细胞在体外单层扩增培养获得软骨组织工程所需要的数量级,此时分化表型成熟的软骨细胞去分化,然后将其用藻酸盐微球三维立体的方式恢复其表型。将再分化的软骨细胞种植于壳聚糖复合支架材料上,利用一种一氧化氮供体药物模拟炎症环境,探讨透明质酸对组织工程样软骨组织的体外保护作用的机制。　　 第一部分：Wistar乳旦膝关节软骨细胞的分离、培养和鉴定。　　 目的：优化大鼠乳鼠膝关节软骨细胞体外分离和培养方法。　　 方法：采用胶原酶消化法获得软骨细胞,相差倒置显微镜观察单层传代软骨细胞的形态改变。免疫组织化学检测原代软骨细胞或去分化软骨细胞Ⅰ、Ⅱ胶原表达。　　 结果：单层扩增传代培养的软骨细胞的形态由多角形向梭形变化。原代软骨细胞表达Ⅱ型胶原蛋白,而去分化软骨细胞则表达Ⅰ型胶原蛋白。　　 结论：两步Ⅱ型胶原酶消化法能减少原代软骨细胞在分离过程中的损伤。单层扩增传代培养是研究软骨细胞分化-去分化很好的模型。　　 第二部分：软骨细胞的去分化和藻酸盐徽球三维立体培养的再分化。　　 目的：研究软骨细胞分化状态改变的临界点以及去分化软骨细胞在藻酸盐微球中的再分化。　　 方法：体外单层扩增培养原代软骨细胞直到去分化状态,采用藻酸盐微球包被去分化的软骨细胞2周以恢复其分化表型‘Western blot和免疫组织化学检测原代软骨细胞、去分化或再分化软骨细胞Ⅰ、Ⅱ胶原蛋白和聚集蛋白聚糖(aggrecan)的表达。透射电镜比较原代软骨细胞、去分化或再分化软骨细胞的超微结构。　　 结果：单层扩增传代培养的软骨细胞的形态由多角形向梭形变化。正常接种密度培养的原代软骨细胞的去分化临界点在第三代左右,低密度接种培养的去分化临界点在第一代左右。随着培养代数的增加,原代软骨细胞表达Ⅱ型胶原蛋白和aggrecan蛋白逐渐降低而Ⅰ型胶原蛋白的表达逐渐升高。藻酸盐微球能显著增加软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白和aggrecan的表达而降低Ⅰ型胶原蛋白的表达。透射电镜结果显示去分化软骨细胞空泡样胞质样结构也得到一定程度的恢复。　　 结论：原代软骨细胞在正常培养密度下其去分化的临界点在第三代左右,低密度明显加速其去分化,而藻酸盐微球三维立体培养能恢复去分化软骨细胞的表型。　　 第三部分：再分化软骨细胞在壳聚糖复合支架材料上的生长评估。　　 目的：研究透明质酸对生长于壳聚糖复合支架材料上的生长状况。　　 方法：采用藻酸盐微球包被去分化的软骨细胞2周以恢复其分化表型的再分化软骨细胞接种于壳聚糖复合材料支架上,持续培养3周。扫描电镜和激光共聚焦显微镜观察在壳聚糖复合之际材料上的生长。　　 结果：藻酸盐微球三维立体培养恢复去分化表型的再分化软骨细胞能在壳聚糖复合支架材料上贴附、增殖、迁徙和分泌细胞外基质。　　 结论：壳聚糖复合支架材料支持再分化软骨细胞的生长,两者表现出良好的生物相容性。　　 第四部分：透明质酸钠对壳聚糖复合支架材料上软骨细胞在硝普钠诱导凋亡下的保护作用。　　 目的：研究透明质酸对生长于壳聚糖复合支架材料上的再分化软骨细胞的保护机制。　　 方法：采用藻酸盐微球包被去分化的软骨细胞2周以恢复其分化表型的再分化软骨细胞接种于壳聚糖复合材料支架上培养3周。分别或联合应用不同浓度的透明质酸,硝普钠和β1整合素阻断型抗体作用与支架材料上的细胞。半定量逆转录一酶链反应(RT-PCR)检测Ⅰ、Ⅱ胶原以及aggrecan的表达。Western blot检测Ⅱ型胶原蛋白的表达。　　 结果：在硝普钠单独作用下Ⅰ、Ⅱ胶原和aggrecan表达呈现出剂量依赖性的降低。而联合使用透明质酸钠后能恢复硝普钠对壳聚糖复合支架材料上生长的再分化软骨细胞的抑制作用,提高其Ⅰ、Ⅱ胶原和aggrecan的表达。而当使用特异性抗体阻断β1整合素信号通路后,透明质酸便不能提高Ⅱ型胶原蛋白的表达。　　 结论：透明质酸保护生长于壳聚糖复合支架材料上的再分化软骨细胞免收硝普钠的抑制作用,而该作用可能通过β1整合素信号通路来实现。