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羊口疮又称羊接触传染性脓疱性皮炎,是由羊口疮病毒引起的绵羊、山羊和某些野生反刍动物的一种常见的接触性、嗜上皮性传染病,该病毒也可感染人。羊口疮病毒属于痘病毒科副痘病毒属,该属病毒还包括牛丘疹性口炎病毒、假牛痘病毒以及红鹿、松鼠、海豹副痘病毒。羊口疮呈世界性分布,近年来发病率逐年上升,引起人们广泛关注。羊口疮病毒基因组由双链线状DNA组成,大约138kbp,编码132个假定基因;其中羊口疮病毒B2L基因编码约42kDa是具有高免疫原性的主要囊膜蛋白,该蛋白与牛痘病毒主要囊抗原p37K同源。人们已根据保守的B2L基因进行羊口疮病毒的检测,分子特征描述和进化树分析。随着羊口疮流行范围的日益扩大,亟需建立统一标准的诊断方法,对羊口疮的流行状况进行评估,进而为防控羊口疮提供技术支撑。基于此,本实验进行了如下研究:1羊口疮病毒甘肃株的分离与鉴定利用HeLa细胞从甘肃某地发病绵羊痂皮病例中分离羊口疮病毒;根据NCBI羊口疮病毒B2L基因序列,采用Oligo6.0生物软件设计一对特异性引物,PCR扩增保守B2L基因;运用MEGA4.0.2对获得羊口疮病毒株B2L基因核苷酸序列和其它羊口疮毒株以及副痘病毒属其它成员进行多序列比对,最大似然法构建系统发育进化树。结果表明:接种羊口疮病毒的HeLa细胞在接种后3～4d内产生细胞病变(CPE),表现为细胞聚集、融合、圆缩,直至脱落的特征性病变;用设计的特异性引物对病毒基因组DNA进行PCR扩增,电泳显示扩增出约1137bp的清晰条带,与目的基因片段长度一致;与参考序列相似性为99%,提交NCBI获得登录号HQ694772;系统发育进化树表明分离的羊口疮病毒属于Ⅰ支,与羊口疮病毒吉林分离株亲缘关系近。以上结果说明成功分离到羊口疮病毒,将其命名为Orf-GS株。2羊口疮病毒B2L重组蛋白的原核表达及纯化在大肠杆菌Rosetta(DE3)plyS中成功表达了B2L重组蛋白,并对TPTG浓度、诱导时间和温度等诱导条件进行优化,最终确定温度28℃、IPTG浓度0.4mmol/L、诱导表达4h为B2L融合蛋白的最佳诱导表达条件;由于该蛋白以包涵体的形式表达,采用DOC和SKL对包涵体进行处理,经镍株纯化B2L融合蛋白,SAS-PAGE电泳结果表明在42 kDa左右获得纯化目的蛋白;免疫印迹结果分析显示,该融合蛋白具有良好的免疫反应原性。3羊口疮ELISA检测方法的建立选用重组B2L蛋白作为包被抗原,探索重组蛋白作为诊断抗原建立间接ELISA检测方法的一系列条件。通过方阵试验,确定了抗原最佳包被浓度为0.5μg/孔,血清的最佳稀释度为1:100。实验证实该ELISA检测方法的特异性、敏感性、重复性均较好。