绵羊是重要的经济动物和实验模式动物。但是,与其他家畜相比,绵羊的基因组研究显得相对落后,至今没有一张基因组序列图谱可供参考。本研究目的就是利用现有的绵羊BAC文库,填补位于MHC(major histcompatibility complex,亦称OLA,Ovine Leukocyte Antigen)物理图谱中ClassⅢ和ClassⅡa间的空位(gap),构建完整的绵羊OLA区段的物理图谱,然后对OLA区段碱基序列进行测定,并依据此序列与其它已知物种MHC区段的基因组序列进行比较分析,注释绵羊OLA区段,为将来绵羊全基因组测序、比较基因组分析提供坚实的序列基础。　　 本研究利用Southern dot blotting、Fingerprinting、PCR screening and certification等实验从19万个BAC克隆中筛选到了克隆304C7(登录号:FJ985867)和222G18(登录号:FJ985862),叠加填补了OLA区段的ClassⅢ和ClassⅡa间的gap,构建了26个BAC克隆覆盖的完整OLA物理图谱。继而对覆盖OLA26个有效BAC克隆进行Shotgun测序,共进行了591560次测序反应,平均克隆覆盖度为7-8倍,有73945个读长(Reads)参与序列叠加,最终获得OLA区段跨度为2.4Mb的基因组序列。证实绵羊的MHC区段分为两个不连续的部分,一部分为2.07MB,另一区段跨度为364kb,而两个部分具有相同的GC含量(均为47.1％)和相近的重复序列。同时根据对获得的序列信息进行Genscan扫描,共发现177个编码基因,其中,131个已知基因,参与多个生理途径,36个预测基因,还有10个新基因。177个基因中,145个在绵羊中为首次报道的基因。为了验证新基因的存在,本实验克隆了其中4个新基因:OaN2、OaN4、OaN5和OaN6,通过RT-PCR、Northern blotting对这4个新基因在心、肝、脾、肺、肾、胰腺、肠系淋巴结7个组织的表达进行了分析；同时制备了OaN2的抗体,利用Western blotting和免疫组化对其进行了表达分析,发现此4个基因在绵羊肠系淋巴结中均有表达,推测它们可能与绵羊的肠系抗病相关。同时与Rfam数据库进行Blast分析,预测了OLA区段存在18个microRNA基因,表明OLA区段也是受非编码RNA调节的基因组区域。　　 在与其它已知物种如人、黑猩猩、小鼠、牛、猪等哺乳动物MHC区段的比较分析中发现,绵羊MHC区段发生了一个大尺度染色体倒位,从而导致此区段的不连续。其中ClassⅠ-ClassⅢ-ClassⅡ区段长度为2.07Mb,ClassⅡb区段长度为364 kb。　　 本研究中进行基因组图谱构建与序列的基础是基因组BAC文库,但在文库构建及利用过程中,我们发现了克隆遗传不稳定的现象。本研究中,克隆遗传不稳定性是指克隆宿主菌不能稳定承载外源重组质粒,从而造成质粒丢失的现象。BAC的实质是载体(Vector)和宿主大肠杆菌系统,重组DNA技术的核心内容也是该系统的利用,故克隆遗传不稳定现象是一个亟需解决的既有理论意义又有应用价值的重要问题。同时在BAC文库构建与利用中,克隆遗传不稳定的现象时常发生,但缺乏关于其因为和机理报道。故本研究对BAC文库构建及分子克隆中发生的克隆遗传不稳定的现象进行了探讨,以便在实验和生产中去创造遗传更加稳定的载体/宿主菌系统。　　 本研究中成功地构建了129SvJ小鼠、荣昌猪、草鱼、阴道滴虫和岩溪晚芦等5种物种的基因组BAC文库。在构建这些物种的基因组BAC文库过程中,发现了质粒不能稳定遗传的克隆,即当插入片段大于200kb时,转化后获得的克隆酶切分析发现,质粒消失的现象增多。通过继代培养和Fingerprint分析发现,质粒不能稳定遗传的克隆在多世代继代培养中,质粒会变小进而逐渐消失,但克隆依然可以在氯霉素筛选培养基上生长。于是我们设计了质粒pCC1BAC上的氯霉素抗性基因的引物,以不稳定遗传的宿主菌基因组为模板进行PCR扩增,得到了氯霉素抗性基因,又以氯霉素抗性基因为探针,对克隆遗传不稳定的宿主菌基因组进行Southern Blotting分析发现了宿主菌基因组上氯霉素基因的杂交信号,证实宿主菌EPI300基因组与外源质粒间发生了重组。依据上述实验,可以推断质粒与大肠杆菌基因组间的重组是质粒不能稳定遗传的因为之一。　　 利用重组酶RecA的抗体对宿主菌株EPI300进行Western Blotting分析证实在实验中所用宿主菌EPI300是重组酶RecA缺失菌株,同时我们对克隆遗传不稳定的宿主菌进行了生理形态的扫描电镜观察,没有发现噬菌体感染,排除了噬菌体导致重组的可能。以上实验说明,原核生物大肠杆菌的DNA重组还存在另外一条不依赖重组酶RecA参与的途径。