微生物视紫红质NdR2的光驱动离子转运功能研究

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NdR2是2013年在海洋黄杆菌(Nonlabens dokdonensis)中发现的一种全新的微生物视紫红质,目前针对该蛋白的功能及光谱的研究较少。首先,分别在体内(E.coli)和体外(Proteoliposome)两个系统中测定了光照下的溶液pH变化,结合不同盐离子及解耦联剂CCCP/TPP对溶液pH的影响,证明NdR2是一个光驱动的Na+/Li+/H+泵,离子从细胞内向细胞外转运。在Na+和Li+溶液中,NdR2分别转运Na+和Li+;在K+、Mg2+和Ca2+等较大离子条件下,该蛋白则转运H+。在该鉴定实验中,成功制备了NdR2Proteoliposome,不仅能排除杂蛋白干扰,而且首次发现Proteoliposome中的蛋白定向度与E.coli中的相同。  在离子转运活性的Na+和H+浓度依赖性实验中,发现在低浓度Na+(<20mM)溶液中,NdR2能同时转运Na+和H+,以转运H+为主。随着Na+浓度升高,蛋白转运Na+的初始速率加快。通过Michaelis-Menten公式的非线性拟合,从而计算出在pH7.5和pH6.5条件下的KM值分别为31.4mM和74.3mM。这不仅表明当溶液pH降低时,蛋白对Na+的亲和力降低,同时也表明Na+和H+存在竞争性转运。继续增加溶液中Na+(>200mM)浓度,蛋白的Na+转运活性逐渐降低。在不同pH条件下,首次发现NdR2的钠离子转运活性在pH7.5下达到最大。继续升高溶液pH,离子转运速率则随之下降。而在pH5.7的酸性条件下,NdR2在高浓度(100mM)Na+溶液中却呈现出显著的H+泵的活性,向细胞外转运H+。  在光谱分析实验中,初步发现,NdR2在Na+和K+溶液中(pH8.0)的紫外可见吸收光谱相同,表明Na+结合位点可能远离视黄醛分子。在碱性pH溶液中,NdR2的吸收光谱没有发生变化;但是在酸性条件下,NdR2的吸收峰发生红移,表明蛋白Schiffbase的平衡离子(Asp116和Asp251)可能发生质子化。分析NdR2在酸性pH下的吸收差谱得到两个pKa值(6.3和4.9),为酸性条件下的离子转运活性变化提供参考依据。闪光光解实验发现当溶液pH由8.0升高到10.0,蛋白的光循环中间态(基态和O态)动力学减慢,进一步表明随着pH升高离子转运活性降低。  NdR2的Na+/Li+/H+转运功能有利于细菌适应不同的海洋环境。NdR2能够将光能转变为跨细胞膜的Na+和H+电化学梯度,最终细胞用于合成ATP、摄取营养物质、细胞运动、调节细胞内pH及维持细胞内低Na+。另一方面,由于Li+对细胞具有毒性,因此NdR2向膜外转运Li+同样具有重要意义。最后,NdR2作为光驱动的Na+泵,在光遗传学领域中具有潜在的应用前景。
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