论文部分内容阅读
黑腹果蝇Drosophila melanogaster Meigen(Diptera: Drosophilidae)是一种典型的日行性趋光性昆虫，对UVA辐射波段（400-315 nm）的光波十分敏感。本研究以模式昆虫黑腹果蝇为研究材料，研究了不同UVA辐射强度(350μW/cm2和1，000μW/cm2)和诱导时间（0h、0.5 h和1.0 h）的处理条件下，果蝇体内响应UVA辐射的分子应答机制并通过后续的分子生物信息分析，深入探究了UVA辐射相关应答基因的表达模式和生物学功能，以期从转录水平上研究昆虫应答UVA辐射的分子机制。 主要研究结论如下: 1.UVA辐射诱导果蝇SSH文库的构建 本论文采用抑制性消减杂交技术(SSH)构建了UVA辐射（辐射强度为:350μW/cm2和时间为:0.5h）诱导后黑腹果蝇差异表达cDNA文库，并利用了荧光定量PCR(qRT-PCR)技术对SSH文库的结果作了进一步的验证。在构建的正向和反向SSH文库中，共检测到了113个差异表达Expressed Sequence Tags(ESTs);采用生物学过程Gene Ontology(GO)功能分类对差异表达的ESTs进行了功能注释，131个ESTs中有102个ESTs获得GO注释，102个获得GO注释的ESTs按功能分为10大类，在这10大类ESTs功能分类中，以细胞代谢（能量代谢和蛋白质代谢）和胁迫响应（胁迫应答和氧化还原作用）相关的ESTs数量最多;最后，分析了主要的差异表达基因的上游调控区域，获得了多个与信号传导路径相关的TranscriptionFactor Binding Motifs(TFBMs)调控序列。本研究表明，UVA辐射能够诱导果蝇体内mRNA水平的应答响应，响应机制涉及到果蝇体内细胞生命活动的各个方面，各项生理活动协同作用使黑腹果蝇在UVA辐射下建立起新的体内平衡。 2.果蝇头部组织RNA-Seq文库构建 为了研究果蝇应答UVA辐射（辐射强度为:1，000μW/cm2和时间为:0h、0.5 h和1.0 h）时头部组织内表达基因的响应机理，本论文采用了高通量RNA-Seq技术鉴定出大量与响应UVA辐射相关的表达基因并对其进行了Pathway路径分析，预测和确定了显著性富集的信号传导途径，包括MAPK、ErbB、chemokine、Calcium和Wnt信号传导路径;利用Short Time-series Expression Miner(STEM)软件对3个RNA-Seq差异表达文库中共13，362个表达基因进行短时表达模型分析，结果显示5506个表达基因被排列到15个表达模型中，其中有6个模型(profile0、profile2、profile3、profile4、profile7和profile10)是显著性表达模型，并根据基因表达趋势的相似性将这6个显著性表达模型聚类成3大类模型，且对这3大类表达基因进行了GO功能的显著性富集分析，分别得到了36、33和31个显著富集的GO条目，其中在生物学过程GO功能分类中，胁迫响应功能的GO条目在3类模型中都显示较高的富集值，如胁迫应答(GO:0050896)和免疫反应(GO:0002376)，此外，代谢过程(GO:0008152)和细胞过程(GO:0009987)功能的GO条目在3个表达模型分类中都占居最高比例的富集值。本研究初步揭示了，黑腹果蝇不仅可以感知UVA辐射光信号，而且还涉及了多种不同的策略机制来响应和抵消UVA辐射诱导的应激反应。本研究的结果可以为进一步探讨昆虫响应UVA辐射的应答反应提供科学依据。 3.UVA辐射对果蝇体内GG7708转录水平和ACh含量的影响 本论文探讨了UVA辐射与果蝇体内CG7708基因表达和乙酰胆碱(ACh)含量的关系，比较分析了果蝇不同趋光特性的两种虫态（幼虫和成虫）在应答UVA辐射时体内CG7708基因表达和ACh含量的变化情况。结果显示，不同UVA辐射强度和处理方式均能对果蝇（幼虫和成虫）体内CG7708基因表达和ACh含量产生显著性影响(P＜0.01);且两者在果蝇不同趋光特性虫态间存在着显著性差异(P＜0.001)。此外，UVA辐射条件下，果蝇体内CG7708基因表达水平和ACh含量相关性分析结果显示，仅在1，000μW/cm2强度的UVA辐射条件下，幼虫体内CG7708基因表达水平与ACh含量呈显著的负相关关系(P＜0.05)，回归方程为:Y=-0.0023X+3.3764，这说明在特定条件下，CG7708基因的表达确实与ACh的合成存在相关性。本项研究推测CG7708和ACh在UVA辐射诱导的神经信号传导中起到一定的调控和应答作用。