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食管癌是严重威胁我国人民健康的恶性肿瘤。经过多年的研究，食管癌的手术后五年生存率仍然维持在20％～30％左右。免疫治疗已成为继手术、放疗、化疗之后最有希望提高生存率和生活质量的方法。过继性细胞免疫治疗(Adoptivecellularimmunotherapy，ACI)是目前主要的免疫疗法之一。可用于过继性细胞免疫治疗的细胞种类主要有LAK细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)等。CTL的主要来源有外周血单个核细胞、TIL及肿瘤引流淋巴结(TDLN)。树突状细胞(DC)以其强大的抗原提呈作用在过继免疫治疗中占有重要地位。TDLN中含有大量DC和T淋巴细胞。这些细胞在体内长期接受肿瘤抗原的刺激，具有对肿瘤的特异性和敏感性，但由于在体内受到肿瘤的抑制，无法发挥正常功能。本试验采用体外培养TDLN细胞，恢复DC和T淋巴细胞的活性，扩增其数量，研究TDLN细胞对自体瘤细胞杀伤作用。
方法：第一部分：术中切取食管癌无转移引流淋巴结2～4枚，获取单个核细胞，悬于30ml含IL-2175U/ml(I-TDLN组)或IL-2175U/ml，IL-4500U/ml，GM-CSF100U/ml(G-TDLN组)的RPMI1640培养基中，置于饱和湿度、37℃、5％CO2培养箱中进行培养。观察细胞形态学变化；测定培养第7天、第14天、第21天收获细胞数；采用流式细胞技术(FCM)检测第14天时收获细胞中CD3+、CD8+、CD4+、CD56+、CD83+细胞的比例；采用酶联免疫吸附试验(Enzyme-linkedimmunoabsorbentassay，ELISA)检测培养上清液中第7天、第14天、第21天IL-12、IFN-γ和TNF-α的含量；采用流式细胞技术检测收获细胞的DNA倍体情况。第二部分：利用外周血淋巴细胞培养获得LAK细胞，采用MTT法对比LAK细胞、I-TDLN细胞和G-TDLN细胞对自体瘤细胞和人食管癌细胞株TE-13细胞的杀伤率。第三部分：术中切取食管癌肿瘤组织块。将其切成1mm3接种到30只3～4周龄BLAB/C裸鼠腋背部皮下建立荷瘤裸鼠模型。一周后随机分为五组：空白对照组、IL-2治疗组、LAK细胞组、I-TDLN细胞组、G-TDLN细胞组，分别注射生理盐水0.2ml；IL-21000u/ml0.2ml；LAK细胞2×107/ml0.2ml+IL-21000u/ml0.2ml；I-TDLN细胞2×107/ml0.2ml+IL-21000u/ml0.2ml；G-TDLN细胞2×107/ml0.2ml+IL-21000u/ml0.2ml。除空白对照组外，其他各组每只裸鼠每3天局部注射IL-21000u/ml0.2ml一次。测量记录肿瘤的最长径(a)和最短径(b)，按体积(V)=πab2/6计算肿瘤体积；计算抑瘤率；HE染色观察肿瘤细胞形态，免疫组织化学染色检测瘤组织中T细胞和DC浸润情况，利用流式细胞术检测移植瘤肿瘤细胞凋亡率和Fas、Fasl、Bax、Bcl-2和Survivin蛋白的表达。
结果：1.TDLN的细胞学形态：培养5～7天时有细胞群落形成；免疫荧光染色显示细胞群落中既有淋巴细胞也有DC。2.细胞生长情况：1.0克淋巴组织在培养的第7天、第14天、第21天获得的细胞数(×108)分别为：I-TDLN组，1.00±0.35(第7天)、1.37±0.25(第14天)、1.18±0.28(第21天)；G-TDLN组，1.02±0.4(第7天)、1.41±0.39(第14天)、1.21±0.39(第21天)。重复测量方差分析显示两组间差异不显著(F=3.384，P=0.96)；I-TDLN组收获细胞数在第7天、第14天、第21天间存在显著差异，其中第14天细胞明显多于第7天和第21天(P＜0.001)；G-TDLN组收获细胞数在第7天、第14天、第21天间存在显著差异，其中第14天细胞明显多于第7天和第21天(P＜0.001)。3.TDLN细胞的免疫表型分析：TDLN细胞表型分析结果显示，TDLN细胞主要由CD3+T细胞和CD83+成熟树突状细胞组成。I-TDLN组收获的细胞中CD3+、CD4+、CD8+、CD56+、CD83+的比例分别为81.7％±5.5％、49.7％±4.2％、30.3％±7.5％、8.8％±3.1％、20.1％±4.7％；G-TDLN组收获的细胞中CD3+、CD4+、CD8+、CD56+、CD83+的比例分别为83.3％±3.6％、42.4％±4.8％、38.8％±3.1％、9.5％±3.0％、30.8％±2.1％。G-TDLN组CD4+、CD8+、CD83+比例与I-TDLN组存在显著差异(P＜0.05)。4.培养上清液中细胞因子的检测：①I-TDLN组上清液中TNF-α的含量(ng/m1)在培养第7天、第14天、第21天时分别为59.7±17.7、62.3±12.2、55.1±10.4；G-TDLN组上清液中TNF-α的含量在培养第7天、第14天、第21天时分别为55.3±13.2、61.2±7.6、56.9±5.1。重复测量方差分析显示两组间TNF-α的含量无显著差异(F=0.045，P=0.836)；I-TDLN组上清液中TNF-α的含量在培养第7天、第14天、第21天无明显差异；G-TDLN组上清液中TNF-α的含量在培养第7天、第14天、第21天无显著差别。②I-TDLN组上清液中IFN-γ的含量(ng/m1)在培养第7天、第14天、第21天时分别为36.3±5.0、47.5±5.1、45.3±3.8；G-TDLN组上清液中IFN-γ的含量在培养第7天、第14天、第21天时分别为55.1±3.8、62.3±5.9、58.8±6.1。重复测量方差分析显示两组间IFN-γ的含量差异显著(F=55.757，P＜0.001)，I-TDLN组上清液中IFN-γ的含量明显低于G-TDLN组；I-TDLN组上清液中IFN-γ的含量在培养第14天、第21天明显高于第7天时(P＜0.05)，第14天、第21天间无显著差别；G-TDLN组上清液中IFN-γ的含量在培养第14天、第21天明显高于第7天时(P＜0.05)，第14天、第21天间无显著差别。③I-TDLN组上清液中IL-12的含量(mol/L)在培养第7天、第14天、第21天时分别为13.5±2.9、15.0±1.9、13.3±2.9；G-TDLN组上清液中IL-12的含量在培养第7天、第14天、第21天时分别为16.3±3.2、23.4±5.7、17.0±5.5。重复测量方差分析显示两组间IL-12的含量差异显著(F=5.856，P=0.036)，I-TDLN组上清液中IL-12的含量明显低于G-TDLN组；I-TDLN组上清液中IL-12的含量在培养第7天、第14天、第21天无显著差别；G-TDLN组上清液中IL-12的含量在培养第14天明显高于第7天、第21天(P＜0.05)，第7天、第21天时无明显差异。5.G-TDLN细胞和I-TDLN细胞中均未检测到异倍体细胞。
结论：
1.通过对TDLN细胞的培养可以获得大量成熟DC和T细胞。
2.在培养基中添加GM-CSF和IL-4可以收获更多的成熟DC和CD8+T细胞。
3.培养第14天左右时细胞活性最强。
4.通过此方法收获的TDLN细胞中无癌细胞残留。
5.I-TDLN和G-TDLN细胞对自体肿瘤细胞具有很强的杀伤活性，G-TDLN细胞强于I-TDLN细胞。
6.I-TDLN和G-TDLN细胞对自体肿瘤细胞的杀伤有特异性。
7.I-TDLN细胞和G-TDLN细胞对裸鼠移植瘤具有很强的杀伤活性，G-TDLN细胞强于I-TDLN细胞。
8.I-TDLN细胞和G-TDLN细胞能诱导肿瘤细胞凋亡，对肿瘤细胞的Bax/Bcl-2和Survivin蛋白表达有影响。