基于固态纳米孔的DNA单分子探测与控制研究

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固态纳米孔是近年来逐渐兴起的单分子探测器件,它主要被用作DNA、蛋白质等生物大分子的探测。纳米孔单分子探测的原理是这样的:在外加电场的作用下,纳米孔中会有稳定的离子电流通过。当一个分子进入纳米孔时,其中的离子电流会有一个阶跃下降,而当分子整体穿过纳米孔时,离子电流又会恢复到原来的水平。所以可以根据离子电流的变化,来判断是否有分子穿过纳米孔以及分子本身的特征信息。  固态纳米孔的制作:首先通过微纳加工手段把4英寸硅片加工成3mm×3mm的周期芯片阵列,接着利用透射电子显微镜聚焦电子束,在每个3mm×3mm芯片的SiN悬空膜上,打出一个直径10nm左右的纳米孔。这是我们实验的主要工艺器件准备。  在泳池实验中纳米孔芯片要浸在离子溶液中,因此溶液中固态纳米孔的稳定性和表面演化规律是一个十分重要的问题。本文利用透射电镜形貌表征和元素分析的方法,系统研究了SiN纳米孔在去离子水、酒精、KCl溶液中的尺寸演化规律。我们发现在浸润1小时后,酒精中的纳米孔会全部收缩,而浸润在去离子水和KCl溶液中的纳米孔的面积会分别收缩30%和20%。通过元素成分分析我们发现纳米孔附近发生了强烈的表面氧化。pH=13的KCl溶液中,我们发现纳米孔的面积会扩大而不是缩小。  经过长时间实验摸索,找到了很好的泳池浸润方法,并成功实现了不同长度DNA分子的探测,可以在单次实验中实现穿孔事件过万的测量,通过实验验证了阻塞电流以及穿孔时间随不同电压的变化关系,这为接下来的时间分辨率研究提供了很好的基础。DNA分子在高pH下会裂解成单链,单链的探测是实现测序的基础。单链的探测需要在较高的pH下进行,高pH时单链DNA分子会疏解开,有利于穿孔,而在低pH下,DNA容易团簇,很容易堵住纳米孔。我尝试了高pH下单链DNA分子的探测实验。本文实现了15kb、33kb等长链DNA的探测,并尝试探测了长链上的特征点,这可为现有二代测序组装降低工作量并提高组装的准确度。  泳池实验用的膜片钳放大器的最高分辨率是4μs,要实现10kbDNA分子的单碱基分辨就要求其穿孔时间至少达到40ms以上,而现在100mV外压下,10kbDNA分子的穿孔时间大约是400μs,所以要实现测序必须想法降低DNA的穿孔速度。本文提出用琼脂凝胶对DNA分子穿孔进行减速控制,并用多种方法实现了把琼脂凝胶转移到我们的纳米孔外缘,DNA在穿过纳米孔的过程中受到琼脂凝胶的牵扯,实现了DNA穿孔时间的减速控制。我们的穿孔时间结果主要分布在几十毫秒到几百毫秒之间,有的穿孔时间已经达到秒的量级,可以满足实现单碱基分辨的客观要求。  接下来,可能要尝试与石墨烯纳米孔等有空间分辨率的纳米孔结合,既有空间分辨率,又有时间分辨率,为最终实现直接测序提供可能。
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