【摘 要】
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利用途径工程的基本原理,拟在大肠杆菌核苷代谢途径中构建腺苷转化为腺苷一磷酸(AMP)的新的代谢网络.该文首先完成了对酵母腺苷激酶基因的功能鉴定.随后利用同源重组的原理,
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利用途径工程的基本原理,拟在大肠杆菌核苷代谢途径中构建腺苷转化为腺苷一磷酸(AMP)的新的代谢网络.该文首先完成了对酵母腺苷激酶基因的功能鉴定.随后利用同源重组的原理,用卡那霉素抗性基因替代E.coli BL21(DE3)染色体上的腺苷脱氨酶基因,筛选得到两个重组子B21和B22.经PCR试验和DNA分子杂交试验,验证两个都为同源交换子.另外用卡那霉素抗性基因和腺苷激酶基因替代E.coli BL21(DE3)染色体上的腺苷脱氨酶基因,筛选得到四个重组子B11、B12、B13、B14.经过PCR试验和DNA分子杂交试验,验证B11和B12为同源交换子,B13和B14为同源整合子.用高效液相色谱(HPLC)分析菌株B12、B21活细胞转化腺苷的发酵液,表明在缺失腺苷脱氨酶基因后主要表现为腺嘌呤和次黄嘌呤的积累,而AMP和ATP没有明显积累,这说明引入的腺苷激酶基因未起主导作用.进一步分析大肠杆菌中腺苷代谢途径,认为有必要阻断腺苷磷酸解为腺嘌呤的途径(由嘌呤核苷磷酸化酶催化),以利于引入的腺苷激酶基因发挥作用,使腺苷向AMP和ATP的方向转化.嘌呤核苷磷酸化酶基因(deoD)的体外缺失实验已经完成,为该基因的体内缺失做了准备,以利于腺苷向AMP的转化.
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