戊型肝炎(Hepatitis E, HE)以前称非甲-非乙型肝炎,是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus, HEV)感染引起的一种经粪口途径传播的疾病,呈全球分布。该病属于人畜共患病,对人类健康具有很大的危害,已引起亚洲、非洲等许多发展中国家暴发急性肝炎。研究证实HEV可感染猪、野猪、牛、山羊、绵羊、鹿、灵长类、鸡、犬、贝类、啮齿类等多种动物,在这些动物宿主中以猪的感染率最高,病毒载量最大,而且从中分离到的病毒和人源毒株也有较高的同源性。因此,调查清楚猪群中HEV的存在状况,对防控人戊型肝炎具有重要的公共卫生学意义。1上海地区戊型肝炎病毒分子流行病学研究为了能够准确的了解上海地区戊型肝炎在猪群中的流行情况,从上海郊区的39个猪场中采集1487份粪便样品,通过RT-nPCR(反转录套式PCR)的方法,扩增HEV ORF2的部分片断,通过测序和遗传进化分析来研究病毒的存在状况。试验结果表明,1487份样品中的297份样品为HEV RNA阳性,阳性率20%。297份阳性样品中158份为基因3型阳性,139份为基因4型阳性,分别占总阳性率的10.6%和9.30%,基因3型HEV在感染中占主导优势。各个猪场HEV阳性率在12.1%-36%之间,分型结果显示上海郊区猪场HEV基因型为基因3型和4型,从中选取的12株代表性毒株中8株3型HEV属于3b亚型。4株4型HEV分属于4b、4d和一个新的基因亚型。对不同猪场基因3型和4型HEV的流行情况进行相关性分析后发现,上海郊区猪场基因3型和4型HEV的感染率呈负相关,提示两个基因型在生存和进化过程中可能存在相互竞争的关系。本次调查所关注的3个群体中,2-6月龄的猪群中HEV的感染率最高,为29.7%,其次为1-8周龄的猪群,感染率为6.9%,母猪的感染率仅为3.1%,在调查的群体中为最低。遗传进化分析表明,发现两株新的HEV基因4型亚型病毒株。此外,基因3型HEV在进化树中和一株日本分离株的同源性最高。这说明基因3型HEV在上海分布已经较为广泛,但以前的研究表明,中国境内猪群中只存在基因4型HEV,因此其来源还有待进一步研究。2猪基因3型戊型肝炎病毒上海分离株全基因组序列的测定及遗传进化分析为了进一步分析上海地区猪群中基因3型HEV与人源HEV的关系,本研究采用RT-nPCR方法对前面分子流行病学研究中从猪粪便样品中分离到的一株基因3型HEV(命名为SAAS-JDY5)的全基因组序列进行分片段扩增,并对其5’端和3’端两个末端的序列采用cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE)进行扩增、克隆和测序。测序结果表明SAAS-JDY5去除3’端poly(A)尾全长为7225bp,5’-非编码区(NCR)为26bp,3’-NCR为73bp。5’和3’非编码区之间有3个开放阅读框(ORF),ORF1从27到5135位核苷酸,全长5109bp,编码1702个氨基酸。ORF2从5170-7152位核苷酸,全长1983bp,编码660个氨基酸。ORF3从5159到5500位核苷酸,全长342bp,编码113个氨基酸,此序列已经登陆GenBank,序列号为FJ527832。通过生物学软件,将SAAS-JDY5与其它已报道的88个HEV病毒株核苷酸和氨基酸序列比较后发现,SAAS-JDY5HEV全序列与HEV Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型的同源性在74-87%之间,而与3型HEV的同源性最高为90.8%,其中ORF1与3型HEV核苷酸的同源性为86.1-88.7%,氨基酸同源性为96.3-96.9%；ORF2与3型HEV核苷酸的同源性为88.7-90.8%,氨基酸同源性为97.6-98.9%。ORF3与3型HEV核苷酸的同源性为93.8-98.1%,氨基酸同源性为92.6-98.4%。遗传进化分析表明,核苷酸的进化与基因3型HEV在一个分枝上,表明SAAS-JDY5病毒株为基因3型HEV。本研究首次报道了在中国上海地区分离到的基因3型HEV的全基因组序列。3重组HEV衣壳蛋白的原核表达、鉴定及多克隆抗体的制备由于HEV缺乏成熟的细胞培养模型,目前一般采用ORF2编码的蛋白作为表达抗原,以此来检测HEV特异性抗体。本研究选取猪基因3型HEVSAAS-JDY5ORF21141-1842区域(a.a381-614)基因,在构建重组表达载体pET-32a-p234的基础上,成功地表达了SAAS-JDY5株的p234蛋白,通过进一步的研究证实该重组蛋白具有较好的免疫原性,能够与猪源HEV阳性血清发生免疫学反应。用该蛋白免疫新西兰大白兔,获得了较高的抗体效价,为进行下一步的研究奠定了基础。4猪基因3型HEV上海分离株感染性克隆的构建及体外转录活性的研究由于缺乏合适的体外细胞培养系统,影响了HEV的进一步研究。通过反向遗传学手段获得HEV的感染性克隆后,就可在DNA水平上通过突变、缺失、插入等手段来研究HEV的复制、表达、病毒的重组、病毒与宿主的相互作用等,也可进行抗病毒策略研究,还可以构建新的病毒载体。本研究在已知猪HEVSAAS-JDY5株全基因组序列的基础上,根据基因组和克隆载体的酶切位点,将已经克隆到的9段3型猪HEV克隆片段经过一系列的克隆和亚克隆后,构建了含有基因组全长cDNA克隆的pGEM4z-HEV重组质粒。在pGEM4z-HEV质粒中,cDNA克隆的5’端上游引入了T7启动子序列,并且在T7启动子的上游引入了单一酶切位点Xba I,3’端引入单一酶切位点Hind Ⅲ.基因组进行全长测序后发现了14个核苷酸的突变。不改变其中的沉默突变序列以作为遗传标志,对于其中的错义突变运用大引物PCR技术(Megaprimer PCR)进行定点突变修补突变的碱基,最终获得了含有遗传标志的基因3型HEV SAAS-JDY5林基因组全长cDNA的重组质粒pGEM4z-HEV.为了验证所构建感染性克隆的感染性,首先在Huh7细胞中进行了细胞试验。将含有猪基因3型戊型肝炎病毒SAAS-JDY5株全基因组的以T7启动子启动转录的重组质粒pGEM4z-HEV进行体外转录,成功获得纯化的HEV基因组RNA。将其转染Huh7细胞后连续培养6天,对转染的细胞通过RT-nPCR和间接免疫荧光等方法检测,证明病毒蛋白在转染的细胞中成功进行了表达。结果表明所构建的感染性克隆pGEM4z-HEV具有感染性,为下一步的体内试验提供了可行性参考。5基因3型HEV人工感染SD大鼠的初步研究体外转录后的HEV RNA转染Huh7细胞,通过间接免疫荧光试验和RT-nPCR初步检测为阳性后,进行了动物试验。pGEM4z-HEV感染性克隆线性化后作为模板用体外转录试剂盒进行体外转录,转录后的RNA肝内注射SD大鼠(SPF级),同时设立阴性和阳性对照。所有动物接种后连续观察55天,分别于注射后的0、3、7、14、21、28、35、45、50、55天分别采集大鼠的粪便和血清样品,粪便样品用RT-nPCR检测HEV RNA,血清样品用北京万泰生产的HEV总抗体检测试剂盒检测血清中的抗体,用RT-nPCR检测HEV RNA.检测结果表明大鼠在感染后7天左右在粪便中检测到HEV RNA;感染后14天左右开始出现病毒血症,一直持续到第28天还能在血清中检测到HEV RNA;感染后14天左右血清anti-HEV抗体阳性,而阴性对照中均没检测到HEV RNA和特异性抗体。为了检测是否自然感染的可能,采用两套引物对遗传标志部位进行测序验证,结果证实能够检测到遗传标志。通过本研究证实猪基因3型HEV可以跨种传播给SD大鼠,提示该动物可以作为研究HEV复制及致病机理方面一种理想的动物模型。以上体外体内试验结果证明,含有HEV SAAS-JDY5病毒株基因组全长cDNA的pGEM4z-HEV重组质粒具有感染性。本研究首次在我国构建出了猪HEV基因3型的感染性克隆。综上所述,本研究在充分普查上海市猪群中HEV的流行分布及分析猪群中流行的HEV两个基因型之间相互关系的基础上,对来源于猪粪便中的SAAS-JDY5HEV进行了全基因组序列分析,确定了该地区猪群中流行的HEV的基因型,有利于更深入分析猪源HEV与人源HEV的关系。而且在获得全基因组序列的基础上构建了含有T7启动子的感染性克隆,并通过体外及体内试验证实所获得的转录本具有感染性,成功拯救出了基因3型猪HEV,为HEV的分子生物学研究及基因工程疫苗研究打下基础,填补了国内空白。此外,通过本研究证实了猪基因3型HEV可以经人工感染的方式跨种传播给SD大鼠,提示该动物可以作为研究HEV复制及致病机理方面一种可选的动物模型。