目的：　　 将丙型肝炎病毒(HCV)的核心蛋白Core，包膜蛋白E以及CE融合蛋白通过Bac-to-Bac系统构建重组Bacmids，然后转染昆虫细胞Sf9获得重组杆状病毒，通过免疫荧光和Western-blot检测蛋白在细胞中的表达情况；构建HCV核心蛋白Core的原核表达载体，经诱导表达和纯化得到目的蛋白；为后续进行HCV的检测以及利用杆状病毒载体的特点进行HCV疫苗研究奠定基础。　　 方法：　　 1、构建重组的载体pFBD-F-C，pFBD-F-E，pFBD-F-CE。将已有的正确的T-C、T-E和T-CE通过酶切、连接、转化，将其分别构建到pFBD-GFP载体上。　　 2、重组的Bacmid(Ac-FBD-F-C，Ac-FBD-F-E，Ac-FBD-F-CE)的获得。利用Bac-to-Bac系统，将重组载体(pFBD-F-C，pFBD-F-E，pFBD-F-CE)转化到DH10Bac感受态细胞，在helper质粒的作用下，经重组获得重组Bacmid，并用PCR对重组的Bacmid进行检测。　　 3、重组杆状病毒的获得和扩增及鉴定。将重组的Bacmid质粒转染Sf9细胞，获得重组的杆状病毒(vAc-FBD-F-C，vAc-FBD-F-E，vAc-FBD-F-CE)，将重组的杆状病毒感染Sf9细胞72h，得到扩增后的重组杆状病毒和感染后的细胞，经免疫荧光染色后激光共聚焦显微镜观察，Western-blot检测其在细胞中的表达。　　 4、原核表达载体pET32a-FDSC的构建及鉴定。分别以EcoRⅠ/NotⅠ双酶酶切T-FDSC，将650bp的酶切片段克隆至pET32a的EcoRⅠ/NotⅠ位点，转化感受态受体菌E.coliDH5α，并酶切鉴定。　　 5、原核表达载体pET32a-FDSC诱导条件的优化及目的蛋白的纯化和鉴定。将重组质粒pET32a-FDSC转化到感受态受体菌E.coli.BL21(DE3)细胞，IPTG诱导目的蛋白表达；并从IPTG的诱导浓度，诱导的温度和时间三个方面优化表达条件，Ni-NTA亲和层析柱纯化表达的蛋白，SDS-PAGE电泳分析，Western-blot验证。　　 结果：　　 1、重组载体pFBD-F-C，pFBD-F-E，pFBD-F-CE的构建及鉴定结果：重组载体pFBD-F-C（SalⅠ+PstⅠ），pFBD-F-E(PstⅠ+XbalⅠ),pFBD-F-CE(Pstl+XbalⅠ)，经双酶酶切后电泳显示在大小约2.23kb、3.23kb、3.83kb处呈现明显的条带，表示成功的将HCV的C、E和CE插入到载体pFBD-GFP中。　　 2、经过Bac-to-Bac系统的同源重组获得重组的Bacmid，PCR后电泳在3.3kb，4.36kb，4.96kb处可见特异性条带，PCR结果表明成功的将HCV的C，E和CE插入到杆状病毒的Tn7的左右臂之间，获得了重组的杆状病毒。　　 3、重组的杆状病毒感染Sf9细胞72h后，免疫荧光染色观察发现在感染后的Sf9细胞上均可以检测到红色和绿色荧光，重叠结果显示红色荧光在细胞表面，表明HCV结构蛋白定位在细胞膜上。　　 4、重组的杆状病毒感染Sf9细胞72h后，选用一抗为小鼠抗Flag时Western-blot检测显示：vAc-FBD-F-C感染后的Sf9细胞在21kD处显示有特异性条带；vAc-FBD-F-E感染后的Sf9细胞在63kD处显示有特异性条带；vAc-FBD-F-CE感染后的Sf9细胞在84kD处显示有特异性条带。结果证明能够在重组病毒中检测到HCV结构蛋白的表达，说明HCV结构蛋白能够成功展示在重组病毒粒子表面。　　 5、重组质粒pET32a-FDSC经EcoRⅠ/NotⅠ双酶酶切，电泳显示在650bp和5.9kb处呈现明显条带，表明pET32a-FDSC原核表达载体构建成功。　　 6、pET32a-FDSC诱导表达蛋白的SDS-PAGE电泳验证结果表明用IPTG诱导蛋白表达后，SDS-PAGE电泳分析表达得到的蛋白大小约40.3kD，结果与理论预测相符。　　 7、pET32a-FDSC诱导表达蛋白条件的优化，实验结果表明在37℃用0.5mmol/LIPTG诱导4h能有效地诱导重组蛋白的表达。　　 8、pET32a-FDSC诱导表达蛋白的纯化及Western-blot鉴定结果显示经Ni-NTA亲和层析柱纯化获得目的蛋白，Western-blot检测表明纯化获得的目的蛋白能与特异性抗体相结合。　　 结论：　　 本实验构建了含有HCVC，E和CE的重组杆状病毒，Western-blot检测结果显示含有HCVC的重组杆状病毒感染细胞后在21kD出现特异性条带；含有HCVE的重组杆状病毒感染细胞后在63kD出现特异性条带；含有HCVCE融合片段的重组杆状病毒感染细胞后在84kD出现特异性条带，表明这些重组病毒构建成功，并能够成功地将HCV结构蛋白展示在重组病毒粒子表面。同时用免疫荧光对重组病毒感染的细胞进行检测，结果表明HCV结构蛋白定位在细胞膜上。说明HCV结构蛋白的确展示在病毒粒子表面。原核表达的HCVCore蛋白经过诱导纯化后能够与特异性抗体相结合。构建的真核和原核表达载体表达的蛋白均可以用于HCV的检测，为HCV检测技术的发展及疫苗研究提供可行性基础。