目的：　　 克隆肝细胞生长因子(HGF)基因，构建其重组真核表达载体；观察HGF拮抗经足叶乙甙(VP-16)处理后5株细胞的凋亡发生；转染Raji细胞，观察HGF基因的表达及对Raji细胞凋亡的影响；构建动物模型，观察HGF的抗凋亡和促血管新生的生物学效应，为研究HGF的生物学效应做相关基础工作。　　 方法：　　 1．HGF基因的克隆与重组克隆载体的构建及鉴定　　 由新鲜人肝组织提取总RNA，行逆转录聚合酶链反应获HGF基因cDNA，与载体pMD19-TSimple连接，构建重组克隆载体pMD19-Tsimple-HGF。将重组克隆载体以冷CaCl2法转化E.ColiDH5α并行氨苄青霉素和α-筛选，采用菌落直接PCR、MluI和SalI双酶切及序列分析等方法，证实目的片段的存在和序列正确。　　 2．HGF基因重组真核表达载体的构建与鉴定　　 将转化重组克隆载体pMD19-TSimple-HGF的E.ColiDH5α增菌后，提取重组载体行MluI和SalI双酶切，行琼脂糖凝胶电泳分离后将目的片段进行胶回收并测定浓度，与经相同双酶切的载体pVITRO2-mcs提取物连接成重组表达载体pVITRO2-mcs-HGF。将重组表达载体以冷CaCI2法转化E.ColiDH5α并行潮霉素B(100μg/ml)筛选，经菌落直接PCR、MluI和SalI双酶切等方法确定目标片段的存在。　　 3．细胞培养条件及筛选用潮霉素B浓度的确定　　 在维持底层胶琼脂糖浓度为0.5％的基础上，对上层胶琼脂糖浓度(0.1％～0.5％)和细胞浓度(100个/孔～5000个/孔)进行选择，改良琼脂糖半固体培养体系。取对数生长期的Raji细胞，以终浓度为1×105个/ml分别接种于含10～200μg/ml潮霉素B的RPMI1640培养液，于37℃、5％CO2作静置培养，以培养14天后仍有Raji细胞存活的最低潮霉素B浓度作为筛选用浓度。　　 4．HGF基因的细胞转染与阳性克隆的鉴定　　 采用脂质体转染法行重组表达载体转染Raji细胞。37℃、5％CO2常规静置培养24h后，采用50μg/ml潮霉素B进行筛选。以未处理Raji细胞和仅加脂质体Raji细胞为空白对照，以载体pVITRO2-mcs转染后Raji细胞为阴性对照。取筛选后存活组细胞提取总RNA，行RT-PCR，电泳，检测HGF基因的存在以确定成功转染。　　 5．IIGF基因转染后mRNA表达水平的检测　　 取第1、7、15代HGF基因转染后Raji细胞培养物提取总RNA，逆转录后采用实时荧光定量PCR，检测HGFmRNA的表达水平并评价其表达稳定性，以未转染Raji细胞和载体pVITRO2-mcs转染组为对照。　　 6．HGF基因转染后蛋白表达的检测　　 取对数生长期的HGF基因转染后Raji细胞，采用Westernblot、细胞免疫化学法定性检测HGF蛋白的表达。此外，分别收集第1、7、15代HGF基因转染后Raji细胞培养物上清液，采用ELISA法定量检测HGF蛋白的表达，并评价HGF蛋白表达的稳定性。以未转染Raji细胞组、载体pVITRO2-mcs转染组作为对照。　　 7．HGF基因转染对Raji细胞的生物学性状的影响　　 取HGF基因转染Raji细胞分别作半固体克隆培养、穿刺培养和单层细胞培养，置37℃、5％CO2作常规静置培养。第3天起每天观察细胞的生长情况至14天，观察集落形成情况，分别评价HGF基因转染对Raji细胞的增殖、侵袭和迁徙的影响。　　 8．HGF蛋白抑制肿瘤细胞凋亡的体外实验　　 将处对数生长期的5种肿瘤细胞株(HL-60急性粒细胞白血病细胞系、PC-3前列腺癌细胞系、HeLa宫颈癌细胞系、A549非小细胞肺癌细胞系、Raji淋巴瘤细胞系)分别以1×106/孔接种至6孔板，37℃、5％CO2常规静置培养24h后，适宜浓度VP-16处理6h，加入HGF(终浓度为100ng/ml)，37℃、5％CO2常规静置培养24h，再按相关实验进行操作。以未经VP-16处理的细胞和处理的细胞为对照。　　 9．CCK-8细胞毒性试验　　 于96孔板每孔内加入100μl细胞，加入VP-16处理，置37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育12h，加10μlCCK-8工作液，孵育1～4h，经酶标仪在450nm测定吸光度。　　 10．HE染色检测细胞形态变化　　 以细胞涂片(Raji、HL-60)或细胞爬片(PC-3、HeLa、A549)方式制片，用95％乙醇常温固定2-3min，水洗后，行HE染色，光镜下检测并计数。　　 11．吖啶橙染色检测细胞凋亡　　 制备活细胞悬液，浓度约为1×107/ml。取95μl细胞悬液，加5μl吖啶橙贮存液，混匀。吸一滴于洁净玻片上，盖玻片封片，激光共聚焦显微镜下观察并计数。　　 12．磷脂酰丝氨酸外翻与核膜完整性分析　　 采用AnnexinV/PI双染经流式细胞术检测。收集对数生长期的5种肿瘤细胞株(HL-60、PC-3、HeLa、A549、Raji)，制备单个细胞悬液，离心，PBS洗涤后bindingbuffer重悬，调整浓度为1×106/ml。取100μl细胞悬液，加5μlAnnexinV和5μlPI，混匀常温避光孵育15min，加400μl1×bindingbuffer在1h内用流式细胞仪进行检测。　　 13．HGF基因转染抗淋巴瘤细胞的凋亡作用的体外实验　　 将处对数生长期的HGF基因转染的Raji细胞，以1×106/孔接种至6孔板，37℃、5％CO2常规静置培养24h后，用VP-16(终浓度为100ng/ml)于37℃、5％CO2处理6h，采用同上行CCK-8处理，同时检测其形态学特征(HE染色、吖啶橙染色)和生化特征(AnnexinV/PI)的变化。以未转染Raji细胞和未处理的转染Raji细胞为对照。　　 14．裸鼠体重和肿瘤体积的测量　　 Raji细胞接种裸鼠后每7日用游标卡尺测量肿瘤大小一次，并称裸鼠体重，连续观测8周。8周后称裸鼠体重，拉颈处死裸鼠，剥离皮下肿瘤，测量肿瘤长、短径。肿瘤体积(V)按公式计算：V=3.14/6×a×b2，其中a为肿瘤的长径，b为短径。　　 15．细胞凋亡指数的检测　　 切片常规脱蜡，梯度乙醇水化。20μg/ml蛋白酶K室温消化，采用原位DNA片段末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡。以细胞核中有黑色颗粒者为阳性细胞即凋亡细胞，每例切片至少计数10个400倍视野，以平均每1000个细胞核中含凋亡细胞个数作为凋亡指数。每次实验设阴性对照和阳性对照。　　 16．肿瘤微血管密度的检测　　 采用SP法染色，光镜下进行微血管计数并取其均值：每张切片先在低倍镜(100倍)下全面观察，确定5个血管密度最高区域，在高倍镜(200倍)下进行微血管计数，取各区域均值作为该标本的微血管密度。　　 结果：　　 1．HGF基因的克隆及其重组克隆载体的构建与鉴定　　 新鲜人肝组织提取总RNA后行RT-PCR，可见一约2.3kb的特异性条带，与目的片段大小一致(2229bp)，提示HGFcDNA片段成功扩增。将构建的重组克隆载体pMD19-TSimple-HGF转化E.ColiDH5α，筛选出阳性菌落。将阳性菌落直接PCR产物、重组克隆载体SalI和MluI双酶切产物和重组克隆载体提取物等同时电泳，可见存在与目的片段大小一致的特异性条带(2229bp)，提示pMD19-TSimple-HGF重组克隆载体成功构建。取纯化的重组克隆载体pMD19-TSimple-HGF行测序，序列测定结果与Genebank报道的序列相同，表明重组于载体的HGF基因片段序列正确。　　 2．HGF基因重组真核表达载体的构建与鉴定　　 将构建的重组表达载体pVITRO2-mcs-HGF转染E.ColiDH5α后采用潮霉素B筛选出阳性菌落。将HGF基因的RT-PCR产物、阳性菌落直接PCR产物、重组表达载体SalI和MluI双酶切产物、重组表达载体提取物等同时电泳，发现存在与目的片段大小一致的特异性条带存在(2229bp)，提示重组表达载体pVITRO2-mcs-HGF获成功构建。　　 3．细胞培养条件及筛选用潮霉素B浓度的确定　　 采用24孔板进行半固体培养时，低层胶琼脂糖浓度为0.5％、上层胶琼脂糖浓度为0.3％、每孔细胞数为1000个。潮霉素B浓度以50μg/ml作为转染后细胞筛选用浓度。　　 结论:　　 HGF基因获成功克隆并构建了重组真核表达载体pVITRO2-mcs-HGF，转染Raji细胞可促进其增殖和迁徙及侵袭。细胞实验证实，HGF蛋白可明显抑制VP-16诱导的细胞凋亡，HGF基因转染可明显降低Raji细胞的凋亡。动物实验证实，HGF基因转染可促进Raji细胞在裸鼠的增殖，同时促进血管新生，抑制细胞凋亡，从而促进肿瘤的发生发展。上述结果将有助于深入研究HGF的生物学效应及对淋巴瘤进行基因治疗的探索。