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本论文对谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中依赖于分枝硫醇的马来酰丙酮酸异构酶进行了酶学性质及结构和功能的研究,并根据该酶的性质和特点,建立了新的定性和定量检测分枝硫醇方法。
与中国科学院生物物理所常文瑞组的王睿博士和张平峰博士合作,对Cglutamicum的马来酰丙酮酸异构酶进行了晶体结构和功能研究。研究发现该蛋白严格依赖于分枝硫醇,是首次发现的以分枝硫醇为辅因子,并参与芳烃化合物代谢的酶。该酶的结构和功能单位为单体,可以分为N端和C端两个结构域,N端结构域的核心由5个长的α螺旋组成一个束状结构,并含有一个金属离子结合模体(motif):His52-Glu144-His14s,结合一个Zn2+,这三个氨基酸残基和金属离子对酶的活性都是必需的。C端结构域显示了一个全新的折叠类型:αβαββα折叠,并且C端结构域对酶的活性也是必需的。保守氨基酸残基His52、Glu144、His148、Asp151、Tyr76、Arg82、Arg222、Trp44和Asn56对酶的活性不可或缺,它们与金属离子一起在酶的表面形成了一个活性口袋,推测是该酶的催化活性中心。Streptomyces coelicolor A3(2)的SCO1959与C.glutamicum的马来酰丙酮酸异构酶等同性(identity)为32％,然而该蛋白没有马来酰丙酮酸异构酶的活性。
研究发现C.glutamicum中的马来酰丙酮酸异构酶在一定条件下酶活与分枝硫醇的量成线性关系。在此基础上,建立了简单、快速、特异性高、灵敏度高的定性和定量检测分枝硫醇的方法。测定了24株Actinobacteria菌株中分枝硫醇的含量,并与巯基特异性结合荧光试剂衍生化和HPLC方法的结果进行了比较,两种方法测量得到的结果一致性较好。用定性检测方法对48个属的74株Actinobacteria菌株进行了分枝硫醇的筛选,其中43个属的67株菌株中检测到了分枝硫醇。
检测的放线菌目的菌株有近65％的菌株可以利用龙胆酸作为碳源生长,这暗示着龙胆酸的利用在放线菌目中是普遍存在的。Corynebacterium glutamicumRES167、Rhodococcus BY22、Rhodococcus BY54、Pseudonocardia halophobica AS4.1288T、Kocuria LW7、Microbispora rosea AS4.1339T、Saccharothrix xinjiangensisAS4.1731T、Prauserella rugosa AS4.1215T和Saccharomonospora viridis AS4.1324T菌株中的马来酰丙酮酸异构酶很可能是依赖于分枝硫醇的。大多数菌株没有检测到已知龙胆酸途径相关酶的酶活,这预示着这些菌株中可能有目前未知的龙胆酸途径。
从菌株Arthrobacter nicotianae、Arthrobacter sp.BY31、Arthrobacter sp.LW23和.1anibacter·sp.B’Y48中扩增出来的基因片段编码的蛋白片段与Rv0486(MshA)有一定差异,可能代表了一类与Rv0486结构不一样,但有MshA活性的蛋白。分枝硫醇合成基因的同源基因在.Actinobacteria中普遍存在,并且它们的进化与16S rRNA基因的进化同步性较低,它们是分别进化的。
在Corynebacterium glutamicum中高表达分枝硫醇合成基因可以在一定程度上提高菌株中分枝硫醇的产量,过表达mshA基因的影响最大,说明该基因编码蛋白催化的步骤可能是分枝硫醇合成的限速步骤。
C.glutamicum的砷酸盐抗性与分枝硫醇相关,但砷酸盐抗性并不一定需要结构完整的分枝硫醇,它的中间产物(Cys-GlcN-Ins)即MshD的底物也可能与砷酸盐抗性相关。