缺血/低氧预适应(I/HPC)是一种内源性的保护现象，指间断的亚致死性缺血/低氧刺激能提高机体组织对继发致死性缺血/低氧损伤的耐受能力。I/HPC可发生在多个器官，如心脏、大脑、肝脏、小肠和肾脏等，其发生机制较为复杂，至今仍不清楚。I/HPC现象最早由美国学者Murry等于1986年在心脏研究中发现，而脑I/HPC现象最早由Kitagawa等人于1990年首次报道。根据缺血/低氧诱导组织耐受的时相不同，分为早期I/HPC和晚期I/HPC(或称为第二保护窗口)。早期I/HPC即指在器官组织受到缺血/低氧刺激后几分钟到数小时内诱导的早期耐受，而晚期I/HPC即指缺血/低氧刺激后24～72小时产生的晚期耐受。近年的研究使人们对I/HPC的作用机理有了大体的了解：细胞作为生物体的基本单元，首先感受预适应现象产生的刺激信号，经过细胞表面或内部的受体将信号传导至胞内，启动广泛的信号转导通路。在此过程中包含了一系列重要蛋白激酶的激活及后续的基因表达和新蛋白合成。 目前，应用于研究缺血/低氧预适应的模型有多种，如低氧模型、缺血模型、低温模型、高压氧模型、代谢抑制剂模型、脑泛抑制模型和细胞因子刺激模型等。本室建立了小鼠整体低氧预适应模型，来模拟“自然低氧”的过程。首先结合蛋白凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western blot)等生化技术，半定量观察了低氧预适应小鼠大脑皮层、海马和下丘脑组织内p38MAPK的磷酸化水平和蛋白表达量的变化，并应用免疫组织化学方法进一步验证了免疫印迹的结果，同时应用免疫共定位技术观察了p38MAPK在不同脑区内激活的细胞特异性。其次利用免疫共沉淀、双向电泳等技术，对海马组织内与cPKCβⅡ相互作用的蛋白进行了初步鉴定和分离。实验数据通过One way ANOVA进行统计学检验，以均数±标准误表示，p<0.05为有显著差异。结果如下： 1．小鼠低氧耐受时间的变化随着低氧暴露次数的增多，小鼠的低氧耐受时间明显增加。对小鼠低氧耐受时间统计发现，与低氧1次组的小鼠(H1：16.90±0.20 min，n=30)相比，随着低氧次数的增多(H2～H6)，小鼠低氧耐受时间延长，数据统计显示有显著性差异(P<0.05，n=30)。由统计结果可以看出，早期低氧预适应能快速提高小鼠的低氧耐受能力， H4组可达到H1的两倍以上。同样，晚期低氧预适应组小鼠的低氧耐受时间也有明显延长。 2.p38MAPK在低氧预适应中的变化 (1)低氧预适应小鼠脑内p38MAPK磷酸化水平升高，而蛋白表达量水平不变。 随着低氧次数的增加，小鼠大脑皮层(H2～H6)、海马(H2～H6)和下丘脑组织(H3～H6)内p38MA。PK磷酸化水平显著增高(vsH0：p<0.05，n=6)。但对上述不同脑区的p38MAPK蛋白表达量的结果分析却没有发现显著性差异(vs H0：P>0.05，n=6)。上述结果表明，在低氧预适应的不同阶段，p38MAPK的激活可能参与了低氧预适应的发生发展过程，并且p38MAPK的激活程度与小鼠的耐受时间有一定的一致性，提示p38MAPK的激活可能与低氧耐受时间的延长有关。 选取了H0、H3和H6组小鼠进行免疫组织化学染色来检测磷酸化p38MAPK和总p38MAPK。DAB染色结果与免疫印迹结果一致，在H3和H6组的皮层、海马和下丘脑组织中，磷酸化p38MAPK阳性的细胞数明显增加，统计结果具有显著性差异(vs H0：p<0.05，n=3)。p38MAPK的蛋白表达量(总p38MAPK)的DAB染色结果显示，在三组之间p38M APK阳性细胞的数量无明显的变化。然而，免疫组化结果显示，磷酸化p38MAPK阳性细胞的大小和形态在不同的脑区有不同的特征：在皮层和海马为胶质细胞样，而在下丘脑背内侧核(DM)和未定带(ZI)两个核团内，磷酸化p38MAPK阳性细胞胞体较大，突起较长。总p38MAPK的免疫组化结果显示，不同脑区总p38MAPK的阳性细胞既包括神经元，也包括胶质样细胞。 (2)低氧预适应小鼠脑组织内p38MAPK在不同的脑区激活有细胞特异性。 为了确定表达磷酸化p38MAPK细胞的性质，我们进一步应用免疫共定位技术将磷酸化p38MAPK与不同神经细胞的标志物进行了荧光双标。结果发现，在皮层和海马，磷酸化p38MAPK定位于小胶质细胞内(特异性的标志物为CD11b)，而非星型胶质细胞(特异性的标志物为S100)。在下丘脑内，磷酸化p38MAPK定位于神经元内(特异性的标志物为NF-H)。以上结果提示，不同脑区内的D38MAPK在低氧预适应过程中激活具有细胞特异性，激活后的p38MAPK在不同细胞中可能起着不同的作用。 3. 由于同一种蛋白在细胞内的不同定位可起到不同的功能，所以我们将海马组织内的全细胞蛋白分为胞膜、胞浆和胞核等不同组分。利用cPKCβⅡ的抗体，对各组分蛋白进行免疫沉淀，得到与cPKCβⅡ相互作用蛋白复合物。首先利用已知蛋白的抗体与之相互作用，检测已知蛋白在其中的变化情况；其次，利用双向电泳分离复合物，寻找差异蛋白点。 (1)ERK1/2与cPKCβⅡ相互作用参与了缺血/低氧预适应过程。 以往的研究结果提示ERK1/2与cPKCβⅡ可能存在着相互作用，我们的研究发现，低氧预适应可引起细胞内cPKCβⅡ的激活和ERK1/2蛋白表达量下降，且激活后入核的ERK1/2也明显减少。本实验结果表明，无论在胞浆还是在胞核内，ERK1/2与cPKCβⅡ都存在直接作用，与正常对照组相比，cPKCβⅡ在重复低氧3次和6次的不同组分蛋白中无明显变化，而与PKCβⅡ相互作用的ERK1/2都有下降的趋势，且ERK2的下降有统计学意义(Jp<0.05，n=3)。提不cPKCβⅡ-ERK1/2信号通路可能参与了低氧预适应的过程。 (2)低氧0次、3次和6次后海马胞浆和胞膜蛋白中与cPKCβⅡ相互作用蛋白的初步分离。 目前的研究认为，膜转位是PKC激活的重要形式，在探讨预适应机制的过程中发现，经重复低氧后cPKCβⅡ发生了膜转位现象。因此，提取海马组织的胞浆和胞膜蛋白，并进行双向电泳分离，得到了多种与cPKCβⅡ相互作用的蛋白。经过不同次数的低氧(H3、H6 vs H0)暴露后，其双向电泳结果有明显的差异，即在胞浆和胞膜复合物中，都存在明显差异的蛋白点群。结果还显示胞浆和胞膜中与cPKCβⅡ相互作用蛋白复合物的组成也有很大的差异，即cPKCβⅡ膜转位过程中与不同的蛋白发生了作用。上述对与cPKCβⅡ相互作用蛋白的初步分离和鉴定，为后续蛋白的分离、提纯和鉴定奠定了良好的基础。 综上所述，本实验首先通过对低氧预适应鼠脑内p38MAPK激活水平和蛋白表达量的探讨，发现p38MAPK磷酸化激活而其蛋白表达量并没有发生明显的改变，而且p38MAPK的激活在不同的脑区具有细胞特异性。其次，通过对与cPKCβⅡ相互作用蛋白的初步分离和鉴定，发现ERK1/2与cPKCβⅡ相互作用，并可能参与了预适应的过程。发现经过多次低氧暴露后，与cPKCβⅡ相互作用的蛋白发生了明显变化(即存在差异蛋白点)，可进一步通过质谱等手段对这些蛋白的性质及功能进行研究，从而丰富对脑I/HPC发生发展的分子机制、信号转导通路的构成及各通路之间的相互作用关系的认识，为与低氧性脑损伤相关的高原医学、航天医学及临床医学等领域开发新药提供科学的实验依据。