胡萝卜软腐果胶杆菌HG-49及其ManA酶在苎麻脱胶中的应用

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苎麻是我国特有的天然纤维资源,其纺织品具有韧性强、透气好、吸湿快等优点。苎麻韧皮纤维中包含约30%的胶质,其中包括果胶、半纤维素、木质素等成分。果胶包裹在纤维最外侧,其去除效果直接影响后续脱胶,而半纤维素成分复杂,主要由甘露聚糖、木聚糖构成,其中甘露聚糖约占70%,这些成分在结构上起着粘连纤维素的作用,使两者紧密结合,难以分离。因此,提高果胶与半纤维素去除率是优化脱胶效果的重点。微生物脱胶具有效率高、成本低、绿色环保等优点,是目前研究的热点。本文围绕筛选得到的胡萝卜软腐果胶杆菌及其甘露聚糖酶ManA在苎麻脱胶中的作用开展研究,以期进一步提高果胶与半纤维素的去除率。取得主要研究结果如下:  (1)筛选获得一株高效去除果胶的脱胶菌株,并优化了脱胶条件。以脱胶率为指标筛选得到一株高效脱胶菌株,经鉴定其为胡萝卜软腐果胶杆菌,命名为Pectobacterium carotovorum sp.HG-49。将此细菌应用于苎麻脱胶,优化得到脱胶条件为:浴比1:40,接种量占体系的5.0%,接种菌龄8h,脱胶温度35°C,脱胶时间24h。通过脱胶过程的动态监测,发现在4h–14h之间,HG-49菌体快速增殖,酶活大幅提高,胶质加速降解。各胶质成分相对去除率分别为:果胶(98.12%)、水溶物(75.84%)、脂蜡质(58.86%)、半纤维素(40.81%)和木质素(16.33%),其中果胶降解最为彻底。扫描电镜结果显示脱胶后精干麻纤维光滑。  (2)成功克隆了HG-49中的甘露聚糖酶基因,并进行了原核表达分析。为促进半纤维素及木质素的去除,针对半纤维素中的主要成分甘露聚糖,将来源于胡萝卜软腐果胶杆菌HG-49的甘露聚糖酶基因ManA克隆并进行异源表达分析。经纯化的重组酶ManA比活力为2845.28±46.21U/mL,SDS-PAGE验证其分子量约为73KDa,与预测一致。序列相似性分析显示重组酶ManA属于糖苷水解酶第5家族。  (3)研究了重组酶ManA的酶学性质,并证实其与HG-49在苎麻脱胶过程中具有协同作用。重组酶ManA反应最适pH、温度为7.0、45°C,最适保存pH、温度范围为7.0–8.0、30–45°C;高浓度的Fe2+、Mn2+、Cu2+对酶活有激活作用,Fe3+、Zn2+有抑制作用;巯基乙醇对酶活有激活作用,SDS、EDTA、乙醇、尿素有抑制作用;ManA仅识别并水解含甘露糖的多聚糖且更倾向水解主链中葡萄糖与甘露糖形成的β-1,4-糖苷键;动力学常数Km为5.71mg/mL,Vmax为1.56μmoL/(min·mg)。重组酶ManA与HG-49具有协同脱胶作用,随着ManA在体系中比活力的提高,脱胶率也随之提高,较之HG-49单独脱胶,协同脱胶半纤维素、木质素、总胶质的去除率分别提高了9.98%、2.64%、5.02%。  以上研究促进了胡萝卜软腐果胶杆菌在苎麻脱胶工业中的应用。
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