老年性痴呆又称阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，是一种好发于中老年人的神经退行性变疾病，以记忆丢失和认知功能障碍为典型临床表现。其病因目前尚不清楚，大多认为是一种多病因疾病。近几年许多研究者从各个不同的角度如淀粉样蛋白沉积、雌激素改变、炎症介质、免疫因素、胆固醇因素等探讨AD的病因病理机制和治疗手段，提出了多种假说。其中胆固醇过载假说和雌激素缺乏假说的尤为引人注目。前者认为，胆固醇与淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)的降解密切相关，在Aβ的产生和异常沉积过程中具有重要调节作用，胆固醇过载会导致Aβ的产生增多和过度聚集，引发老年斑的产生。后者指出，雌激素缺乏可能与AD的发病有关。流行病学证实，女性绝经后AD患者多于男性，约为1.5～3：1，而雌激素替代疗法(estrogen replacement therapy,ERT)可以降低AD的发病率。雌激素可以通过多种机制对中枢神经系统发挥保护作用，同时，雌激素还可以影响脂质代谢的酶类，发挥降胆固醇的作用，ERT治疗高脂血症的效果甚至优于单用降脂药物。临床实验证实，他汀类降脂药物对AD具有治疗作用。由此可以推断，雌激素和他汀类对AD的治疗作用与胆固醇的代谢可能有一定程度的关联。 目的：本课题以体外培养的SD胎鼠皮质神经元为研究对象，观察胆固醇对神经元Aβ产生的影响，探讨胆固醇在AD病理发病机制中的作用。同时以具有明确降胆固醇作用的洛伐他汀组为对照，揭示雌激素对抗胆固醇损伤作用的可能机制，探讨其是否具有体外降胆固醇作用，为进一步的体内实验奠定理论基础。方法：SD胎鼠大脑皮质神经元原代培养，接种于96孔和6孔培养板内。随机法分为5组： (1)胆固醇组：神经元体外生长7d后，培养液内加入胆固醇(8μg/ml)，持续作用2d、5d； (2)雌激素+胆固醇组：神经元体外生长5d后加入17β-雌二醇(10ng/ml，无水乙醇溶解)，作用2d后换含有胆固醇(8μg/ml)的培养液，持续作用2d、5d； (3)雌激素组：神经元体外生长5d后，培养液内加入17β-雌二醇(10ng/ml，无水乙醇溶解)，持续作用4d、7d； (4)洛伐他汀组：神经元体外生长5d后，培养液内加入洛伐他汀(4μmol/L，无水乙醇溶解)，持续作用4d、7d； (5)正常对照组：无血清培养基培养持续培养9d、12d。 各组细胞培养9d、12d后终止培养，分别用MTT检测各细胞存活数量和活力、流式细胞术检测细胞的线粒体膜电位(△ψm)变化、双抗体夹心法Elisa检测细胞培养液内的Aβ40的含量、RT-PCR法检测细胞内APP、BACE1 mRNA的相对表达量。所得数据结果用均数±标准差(-X±S)表示，利用SPSS15.0统计学软件分析，P<0.05有统计学意义。计量资料多组均数比较采用方差分析。 结果： 1.本实验建立了SD胎鼠皮质神经元原代培养方法，细胞生长状态好，培养至7d时鉴定显示，神经元比例为90％±4.6％，神经元细胞纯度高，符合实验要求。 2.不同干预条件下，生长9d的各组细胞MTT检测，各组A值分别为：胆固醇组0.719±0.033；雌激素+胆固醇组0.737±0.055；洛伐他汀组0.742±0.067；雌激素组0.733±0.045；正常组0.728±0.041。各组间细胞存活数量差异无统计学意义(P>0.05)。继续作用3d后，也即生长12d时各组细胞的A值分别为：胆固醇组0.602±0.031；雌激素+胆固醇组0.727±0.040；洛伐他汀组0.725±0.039；雌激素组0.721±0.085；正常组0.703±0.059。其中，胆固醇组的细胞活力明显低于正常组，t=6.413，P<0.01，差异有统计学意义，而雌激素+胆固醇组与正常对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。 3.不同干预条件下各组细胞的△ψm，以胆固醇组下降最多。各组正常细胞，即发红色高强度光细胞的百分率分别为：胆固醇组：74.4％±3.37％；雌激素+胆固醇组：89.5％±4.52％；正常组：91.3％±5.17％。胆固醇组与正常组之间均数t检验显示，P<0.01，差异有统计学意义。雌激素+胆固醇组与正常组比较，P>0.10，差异无统计学意义。 4.双抗体夹心法Elisa检测得知，培养液内Aβ40在各组的含量分别是：胆固醇组：491.2±31.14pg/ml；雌激素组：295.8±23.13pg/ml；洛伐他汀组：244.9±22.73pg/ml；正常组：280.9±25.58pg/ml。胆固醇组培养液内Aβ40含量显著高于正常对照组，两组均数t检验显示：t=16.502，P<0.001，差异有统计学意义。洛伐他汀组含量低于正常组，P=0.04，差异有统计学意义。雌激素组与正常组比较t=-1.366，P=-0.189，差异无统计学意义。不同的胆固醇作用浓度下，对应培养液内Aβ40的含量为：胆固醇4μg/ml，Aβ40 321±27.18pg/ml；胆固醇8μg/ml，Aβ40491.2±31.14pg/ml；胆固醇16μg/ml，Aβ40 553±34.18pg/ml；胆固醇32μg/ml，Aβ40 562±37.46pg/ml；胆固醇64μg/ml，Aβ40 564±40.23pg/ml。胆固醇浓度较低时，Aβ40随着胆固醇浓度的增高而增高，继而保持在一个较高的水平。 5.各组细胞BACE1 mRNA的灰度与内参GADPH的灰度比较，比值分别为：胆固醇组：0.779±0.065；洛伐他汀组：0.738±0.029；雌激素组：0.781±0.061；正常组：0.748±0.057。多组均数方差分析显示，P>0.05，各组之间差异无统计学意义，胆固醇、雌激素不能影响神经元BACE-1的mRNA表达。 6.各组细胞APPmRNA的灰度与内参GADPH的灰度比较，比值分别为：胆固醇组：1.31±0.058；洛伐他汀组：0.69±0.037；雌激素组：0.88±0.042；正常组：0.82±0.051。胆固醇组与正常对照组相比显著增高，其差异有统计学意义(P<0.01)，洛伐他汀组与正常组相比，有明显降低，其差异有统计学意义(P<0.05)。而雌激素组与正常组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。 结论： 1.实验浓度的胆固醇(8μg/ml)对体外培养的神经元具有损伤作用，可以使原代培养的神经元细胞线粒体膜电位下降，从而加速凋亡，使活细胞数量和活力明显下降。胆固醇引起Aβ增多可能是胆固醇损伤作用的重要原因之一。而雌激素预先作用2d可以对抗胆固醇引起的神经元损伤。 2.体外8μg/ml的胆固醇浓度可以使原代培养神经元的APP mRNA的表达水平显著增高，洛伐他汀可以有效抑制这一增高趋势，而雌激素不能抑制这一增高趋势。雌激素和胆固醇均不能调节BACE-1 mRNA的表达水平。 3.实验浓度的胆固醇可使原代培养神经元产生的Aβ40显著增多，且增多程度与胆固醇浓度呈正相关。洛伐他汀可以通过降低胆固醇的含量而使Aβ40明显减少，而雌激素不能抑制体外Aβ40的产生。 4.胆固醇引起Aβ40增多可能是通过上调APP的表达，同时增加BACE-1的活性而实现的。 5.体外雌激素并不具备降胆固醇作用，雌激素对神经元的保护作用可能是由于其对Aβ40毒性作用的抵抗。