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荧光共振能量转移(FRET)是一个依赖于距离的光物理进程，处于激发态的荧光团通过偶极子间的相互作用将能量以非辐射的方式转移给邻近的受体分子。FRET效率为供体转移给受体的能量百分比。因供体受体间产生FRET的有效距离小于10nm，且FRET效率与供体受体间距离的六次方成反比，使得FRET技术被广泛应用于研究生物学、医学和材料学中分子间的相互作用及构象的变化。然而许多重要的生物学、物理学问题中，分子之间的距离超过了10nm，限制了FRET技术的应用。近年来的研究表明，在给定的距离内多个受体存在时Forst距离明显增大，FRET效率明显增强，使得具备多个受体的FRET技术能够被广泛的应用于研究分子尺度大于10nm的蛋白质复合物的相互作用以及构象的变化。本论文中，我们致力于研究FRET效率的定量计算方法，重点对多受体FRET结构进行了研究，这为定量化的研究生物大分子的结合和分解提供了强有力的工具。我们的工作主要分四部分： 1.在活细胞中，由Zal和Gascoigne提出的基于受体敏化发射的E-FRET是目前较为流行的探测FRET效率的方法。光谱串扰(SBT)比率是E-FRET方法测量中一个关键性参数。Zal和Gaseoigne在SBT比率为常数值的宽视野显微镜中验证E-FRET方法。在共聚焦系统中我们观察到SBT比率不是常数，而是依赖于荧光强度值的大小，这与Chen和Periasamy观察到的结果一致。本文我们将Elangovan等人提出的PrecisionFRET(PFRET)中SBT计算方法与E-FRET方法结合。实验结果表明这种矫正方法提高了E-FRET方法在共聚焦系统中探测FRET效率的精确度。 2.基于部分受体光漂白，提出多受体FRET结构效率计算的经验公式。目前探测FRET效率的方法主要有荧光寿命法，光谱法，受体敏化发射法和受体光漂白方法。与其他方法相比，部分受体光漂白法不依赖于额外的样本，避免了复杂的系统矫正，与共聚焦显微镜系统的ROI功能结合，对细胞的光损伤仅有0.1％，使其具有极大的潜能来实时探测蛋白质分子之间的相互作用及构象的变化。实验中与光谱法和寿命法测量结果对比，表明现有的部分受体光漂白法在漂白程度小于90％时并不适用于多受体FRET结构效率探测。在此基础上，我们提出了针对多受体(n)FRET结构效率测量公式(emp-PbFRET)。实验结果表明当漂白程度在10-60％时，emp-PbFRET方程可精确的获得FRET效率值。 3.提出光漂白概率依赖于光漂白程度的线性依赖模型，发展了多受体FRET结构效率测量方法(Ma-PbFRET)。相对于emp-PbFRET，Ma-PbFRET拓宽了光漂白程度的适用范围(10-100％)。在活细胞中通过测量具有两个或三个受体的FRET结构的效率，验证了Ma-PbFRET方法的正确性。本研究扩展了现有的FRET技术，为研究蛋白质复合物的结合和分解提供了简单、快捷、强有力的技术手段。 4.利用部分受体光漂白技术实时探测2μM十字胞碱(STS)处理后人类肺腺癌细胞ASTC-a-1中caspase3的活化过程。通过实验进一步表明部分受体光漂白方法可用于动态研究分子间的相互作用。