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microRNA(miRNA)是一类19-25bp内源非编码小RNA，在真核生物中普遍存在。多数miRNA采用Ⅱ型启动子起始转录，转录产物在加工成熟过程中依次经历了三种主要形式：初级转录产物primarymiRNA(pri-miRNA)，发卡状前体(precursormiRNA，pre-miRNA)，和成熟体miRNA(maturemiRNA)。目前有关miRNA功能的研究主要证实其成熟体对靶标基因的表达起负调控作用。
常用的miRNA的研究方法主要是功能缺失或获得实验。测定待研究的miRNA的效应可以在表达该miRNA的细胞系或不表达该miRNA的细胞系中分别进行。对于前者可以通过使用甲基修饰的反义寡核苷酸敲除该miRNA，抑制它的功能活性。对于后者则可以通过转染化学合成的miRNA或转染miRNA表达载体，实现该miRNA功能的增强或获得。直接转染化学合成的miRNA对进行一般的研究工作固然方便快捷，但费用高、转染效果维持短暂，这对满足长周期体外体内实验的要求，适应未来应用于临床治疗等方面都不如miRNA表达载体。
目前文献中报导使用过的miRNA表达载体，按照载体直接转录出的miRNA的形式划分，大致有以下三类，即primarymiRNA载体，precursormiRNA载体，和maturemiRNA载体，这些载体各自的转录产物依次进入内源miRNA加工成熟过程的不同阶段，利用内源miRNA加工成熟通路及内源miRNA行施功能的机制，来实现外源miRNA的表达与功能。对这三类载体转录产生外源miRNA的效率，对内源miRNA的产生及功能的影响，对外源miRNA是否能完全模拟内源miRNA而被整合进入miRISC等各方面的集中比较分析鲜见报道。
本实验起初为了能够找到miRNA的最佳表达载体以及构建特定miRNA靶标基因检测系统，依据相关文献报导结合shRNA的设计原理，以人类miRNAlet-7a为代表，依次构建出pri-miRNA载体，模仿shRNA的pre-miRNA载体，和maturemiRNA载体，以及含有let-7a靶点的荧光效应元件，希望通过分析比较三种形式的miRNA表达载体对含let-7a靶标HMGA23’末端非翻译区(HMGA23’UTR)的荧光效应元件的抑制效果及程度，来初步寻找最佳的miRNA表达载体以及构建let-7a靶标基因3’UTR的检测系统。但在实验过程中发现没有合适的细胞系能够作为工具性细胞系，即不对含HMGA23’UTR的荧光效应元件产生内源性干扰。为了解决这一矛盾，找到miRNA荧光效应元件不受细胞系内源性miRNA表达谱影响的方法，突破细胞系的种类对检测特定miRNA的限制，产生具有普遍适用性的细胞系，我们采用RNAi的方法，直接敲除内源miRNA加工成熟通路上的关键蛋白(但避开外源miRNA加工成熟所需的蛋白)，或直接特异性敲除内源let-7a，尝试构建减少细胞内源miRNA背景对荧光效应元件影响的一种新型的miRNA功能测定系统，以期在这样一个检测系统内对不同形式的miRNAlet-7a表达载体表达外源let-7a的效率进行评价。
在Hela细胞系内我们初步完成了对这一工作的前期准备和探讨研究。通过实验的方法证实了在Hela细胞系中我们自行设计的用于RNAi敲除实验的基础载体质粒pcDNA3-H1和shRNA表达框架是成功的，可以用于进行干扰内源蛋白或干扰内源miRNA表达的实验。通过RNAi实验，发现pcDNA3-H1-sh-A-R-let-7a对含有HMGA23’UTR的荧光效应元件恢复荧光的效果最好。但是荧光恢复的程度相对比较微弱，这对我们今后要进一步对该系统进行改造，提高荧光恢复的强度和效率提出了要求。