研究背景 乙型肝炎病毒(HBV)感染在世界范围内流行，全球大约30％的人口感染HBV，每年至少有100万慢性感染的病人死于慢性肝脏疾病，包括肝硬化和肝癌。我国有1.2亿乙型肝炎表面抗原携带者，有2000万慢性乙型病毒性肝炎(慢乙肝)病人。寻找治疗慢乙肝、慢性病毒携带者的治疗方法是急需解决的问题。 目前用于慢乙肝治疗的药物丰要有抗病毒药物和免疫机能调节药，前者包括核苷酸类似物如拉米呋啶，后者包括胸腺肽和左旋咪唑以及具有抗病毒作用的干扰素。这些药物不仪效果不尽人意，而且价格昂贵，副作用大。随着对乙肝发病机理研究的深入，人们已经认识到宿主对HBV的免疫耐受是慢乙肝发病的关键。利用含HBV表面抗原和核心抗原基因的疫苗免疫能有效的激活机体的特异性体液免疫和细胞免疫。治疗性疫苗可能成为慢乙肝治疗的新突破。 比较早已熟知用于乙肝预防免疫的HBV表面抗原(HBsAg)疫苗，近年来人们对HBV核心抗原(HBcAg)在HBV免疫中的地位越来越重视。现已证明HBcAg在自限性HBV感染病人中是一个Th细胞的重要靶子，而在慢性HBV感染病人中这种针对HBcAg的Th细胞反应很低或消失。用编码HBcAg的DNA疫苗免疫小鼠可激发MHC-I类限制性CTL，从而参与病毒的清除。乙型肝炎病毒对肝细胞受体的相应配体存在于前S1(21～47)氨基酸多肽部分，前S1蛋白的免疫原性比HBsAg为强，因此提示前S1/前S2可能具有改进现用疫苗的保护性。 研究目的 1、表达可用于乙型肝炎治疗性疫苗研究的乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原(HBcAg)与前S1抗原(PreS1)氨基酸(AA)3—55肽段融合蛋白(HBVCS1)。 2、观察融合蛋白抗原HBVCS1诱导小鼠体液免疫应答情况。 3、观察融合蛋白疫苗HBVCS1在HBV转基因小鼠中的免疫治疗效果。 研究方法 1、以原核表达载体pET-lld表达HBV融合蛋白，采用免疫印迹技术和酶联免疫吸附试验(ELISA)分析表达产物的抗原性。 2、实验组和对照组小鼠(Balb/c)，分别腹腔内注射融合蛋白抗原HBVCS1与免疫佐剂(弗氏不完全佐剂和弗氏完全佐剂)，对照组小鼠仪注射弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂。采用酶连免疫吸附方法检测抗原接种前后血清中抗-HBc及其亚类和抗-PreS1。 3、16只HBV转基因小鼠分成两组，在0周和3周时实验组小鼠腹腔内注射HBVCS1与免疫佐剂(弗氏完全佐剂/弗氏不完全佐剂)，对照组仪注射弗氏完全佐剂与磷酸盐缓冲液PBS。采用<3>H-TdR掺入法检测转基因鼠脾淋巴细胞特异性增殖反应，以酶联免疫吸附试验检测血清中的乙肝病毒表面抗原HBsAg，采用荧光定量PCR检测血清中的HBVDNA。 结果 1、HBV融合蛋白在大肠杆菌中有效稳定表达，表达产物具有核心抗原和前S1特异抗原性。 2、实验组小鼠有高滴度的抗-HBc 和抗-PreS1产生，随免疫时间增长，抗-HBc滴度与抗原量正相关(P<0.05)，与佐剂(弗氏完全佐剂与弗氏不完全佐剂)的使用无关(P>0.05)。对照组无特异性抗体产牛。在所抗-HBc IgG亚类中，以IgG2a占优势(IgG2a/IgG1>1)，提示小鼠在免疫后均倾向于产生。IgG2a占优势的Th1型辅助性T细胞应答。 3、实验组(1.99±0.347)转基因鼠脾细胞抗原特异性增殖反应明显高于对照组(1.56±0.149)；实验组第6周(3.58±0.80)与第9周(3.45±0.70)血清中HBsAg终点滴度与第 1 周(4.36±1.04)及第3周(4.81±0.98)以及同一时间实验组与对照组之间HBsAg终点滴度均有显著性差别；实验组小鼠第6周(4.02±0.29)和第9周(3.58±0.17)血清中HBVDNA含量明显低于免疫前(5.55±0.88)，而对照组各批血清无此差别。 结论 1、方法有效表达了HBV融合蛋白，表达产物具有特异抗原性。融合蛋白的表达为进一步进行HBVCS1融合蛋白作为疫苗研究奠定了基础。 2、乙型肝炎病毒核心前S1融合蛋白抗原对小鼠很好的免疫原性，其诱导的免疫有利于慢性HBV感染者体内病毒的清除。 3、HBVCS1蛋白疫苗在HBV转基因小鼠中能诱导特异性免疫，并具有抑制HBVDNA复制和HBsAg表达的治疗效果。