翼状胬肉(Pterygium)为临床常见病、多发病，病理表现为纤维血管组织增生并向角膜侵犯。它常导致美容缺陷，甚至造成视力障碍。翼状胬肉的病因和发病机制尚未完全清楚。目前认为其发生与紫外线照射密切相关，成纤维细胞被紫外线照射后致细胞发生转变而具有侵袭性，也有认为是凋亡控制的失调所致，变态反应性炎症也涉及其中。目前仍以手术治疗为主，但手术治疗使病人产生恐惧心理，且术后复发率较高，现有的防治药物主要是抗肿瘤药，可选择的药物少且副作用多，寻找新的有效的治疗药物具有重要的临床意义。传统的中药具有作用广泛，副作用少等优点，研究证实，由防已科植物提取的生物碱—汉防己甲素(Tetrandrine，Tet))有抗纤维增殖、抗肿瘤、诱导凋亡、抗炎等作用，安全、副作用少。已有报道Tet可抑制体外培养的兔结膜成纤维细胞的生长，但目前尚无用于人体结膜相关疾病的实验研究，本课题首次直接以培养的人体翼状胬肉成纤维细胞及组织本身作为研究对象，探讨中药单体汉防己甲素治疗翼状胬肉的有效性、安全性及作用机制。 第一部分正常球结膜与翼状胬肉成纤维细胞生长增殖状况的对比观察 目的：对比观察在相同的培养条件下翼状胬肉与正常结膜成纤维细胞的生长增殖状况，对两种成纤维细胞的生长增殖特性作出评价。 方法：(1)用含10％胎生牛血清的RPMI1640培养液，在相同的培养条件下体外培养正常球结膜与初发翼状胬肉组织成纤维细胞。 (2)倒置相差显微镜下观察体外培养的两种成纤维细胞的特点，生长增殖状况。 (3)传第三代的翼状胬肉与正常结膜成纤维细胞，分别于接种后第二天、第五天、第八天行噻唑蓝[3-(4，5-dimethyl-2thiazol)-2，5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromid，MTT]比色试验，检测细胞增殖活力(细胞数)。 结果：翼状胬肉成纤维细胞较正常结膜成纤维细胞生长快，旺盛；MTT检测结果显示：第五天翼状胬肉成纤维细胞的细胞总数多于正常结膜成纤维细胞(p＜0.05)，第八天更明显(p＜0.01)。 结论：翼状胬肉成纤维细胞的生长、增殖特性与正常结膜成纤维细胞不同，明显强于正常结膜成纤维细胞，可能其为转化了的成纤维细胞。提示：治疗翼状胬肉药物的筛选和疗效评价的实验研究应直接以翼状胬肉成纤维细胞为研究对象，才能作出较为符合客观实际的评价。 第二部分汉防己甲素抑制翼状胬肉成纤维细胞增殖的实验研究 目的：观察汉防己甲素对体外培养的翼状胬肉成纤维细胞增殖抑制作用并探讨其机制，寻找治疗翼状胬肉和预防其复发的有效药物。 方法：(1)倒置相差显微镜下观察不同浓度的Tet作用下，体外培养的翼状胬肉成纤维细胞形态的变化，并与丝裂霉素(Mitomycin，MMC)进行比较。 (2)MTT比色法测定不同浓度的Tet作用48h对体外培养的翼状胬肉成纤维细胞增殖的抑制作用，并与MMC进行比较。 (3)流式细胞仪检测不同浓度的Tet作用48h，体外培养的翼状胬肉成纤维细胞细胞周期的变化。 结果：(1)体外培养的翼状胬肉成纤维细胞以长梭形为主，放射状排列，Tet作用下，细胞胞体收缩，变圆，间隙增宽，药物浓度高时，见细胞碎裂，浮起。0.01％MMC、0.02％MMC作用下见大量细胞碎裂，溶解。 (2)不同浓度的Tet作用48h对体外培养的翼状胬肉成纤维细胞的增殖均有明显的抑制作用(p＜0.01)；0.01％与0.02％MMC、4×10-5MTet与0.02％MMC对翼状胬肉成纤维细胞活性的影响无显著性差异(p＞0.05)。Tet的IC50接近10-5M(为0.848×10-5M)。 (3)流式细胞仪检测结果显示：Tet作用下，翼状胬肉成纤维细胞周期中S期细胞增多，浓度越高，作用越明显。 结论：汉防己甲素对翼状胬肉成纤维细胞的增殖具有明显的抑制作用，呈剂量依赖性，细胞分裂被阻止在S期(DNA合成期)。可望用于对翼状胬肉的治疗。 第三部分汉防己甲素对翼状胬肉与正常结膜成纤维细胞作用的对比观察 目的：研究汉防己甲素对翼状胬肉和正常结膜成纤维细胞作用的异同；观察汉防己甲素对翼状胬肉成纤维细胞基质金属蛋白酶(Matrixmetalloproteinase，MMP)分泌及表达的影响，以便对汉防己甲素抑制翼状胬肉成纤维细胞的作用作出较全面评价。 方法：(1)在相同的培养条件下，传第三代的翼状胬肉与正常结膜成纤维细胞皆加入不同浓度的Tet，分别于加药后第一天、第三天、第五天行MTT检测细胞的存活率，并与MMC进行比较(第三天)。 (2)收集正常球结膜与初发翼状胬肉成纤维细胞培养的上清液，酶联免疫吸附试验(Enzyme-linkedImmunesorbentAssay，ELISA)检测两种细胞培养上清液中MMP-1、MMP-3、MMP-9的含量及10-5M的Tet作用48h翼状胬肉成纤维细胞培养的上清液中含量的变化。 (3)荧光定量PCR检测10-5M的Tet对翼状胬肉成纤维细胞MMP-3mRNA表达的影响。 结果：(1)用药后第一天，4×10-5MTet、2×10-5MTet两个浓度组对翼状胬肉与正常结膜成纤维细胞作用情况相比，无显著性差异(p＞0.05)，其余各浓度的Tet对翼状胬肉成纤维细胞的抑制作用大于正常结膜成纤维细胞，正常结膜成纤维细胞的存活率大于翼状胬肉成纤维细胞(p＜0.01)。 (2)用药后第三天，4×10-5MTet浓度组翼状胬肉成纤维细胞的存活率大于正常结膜成纤维细胞(p＜0.01)；其余各浓度的Tet对两种成纤维细胞抑制情况相比，无显著性差异(p＞0.05)。0.01％MMC和0.02％MMC组正常结膜成纤维细胞的存活率明显小于翼状胬肉成纤维细胞(p＜0.01)。 (3)用药后第五天，各浓度的Tet组两种成纤维细胞的存活率相比，有显著性差异(p＜0.01)。翼状胬肉成纤维细胞的存活率大于正常结膜成纤维细胞。 (4)培养的初发翼状胬肉成纤维细胞上清中MMP-1、MMP-3含量较正常成纤维细胞上清中含量高(p＜0.01)，加入10-5MTet作用48h后明显下降(p＜0.01)。 (5)培养的正常结膜及初发翼状胬肉成纤维细胞上清中未检测到MMP-9。 (6)初发翼状胬肉成纤维细胞MMP-3mRNA是正常结膜组织成纤维细胞的3倍。10-5M的Tet作用24h后表达量下降了27.12％。 结论：用药后第一天，半数抑制量及以下浓度的Tet在对翼状胬肉成纤维细胞起抑制作用的同时，对正常细胞成纤维细胞造成的影响较小。Tet对翼状胬肉成纤维细胞MMP-1、MMP-3的分泌有明显的抑制作用，并能抑制其细胞MMP-3mRNA表达量。 第四部分汉防己甲素对翼状胬肉组织相关因子分泌的影响 目的：以翼状胬肉组织块分泌的相关因子变化情况为观察指标，了解汉防己甲素对翼状胬肉病变整体作用的情况，为进一步广泛深入地研究其作用提供基础。 方法：收集初发翼状胬肉和正常球结膜组织块体外培养上清液，ELlSA检测上清液中血管内皮生长因子(Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)、白介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)的含量及10-5M的Tet作用48h翼状胬肉组织块体外培养上清液中含量的变化。 结果：(1)初发翼状胬肉组织上清中VEGF含量较正常结膜组织上清中VEGF含量高(p＜0.01)，加入10-5MTet作用48h后明显下降(p＜0.01)，与正常结膜块上清中VEGF含量无差异(p＞0.05)。 (2)初发翼状胬肉组织上清液中IL-1β的含量与正常结膜组织相比无统计学差异(p＞0.05)。 结论：VEGF在翼状胬肉新生血管形成中发挥着重要作用。汉防己甲素对翼状胬肉组织中VEGF的分泌有明显抑制作用，展示了良好的应用前景。IL-1β在翼状胬肉中的作用需进一步研究。