背景:猪链球菌2型是重要的人兽共患传染病病原菌,呈世界分布,在养猪业发达的国家则更为广泛。早在20世纪50年代,在英国和荷兰就有人报道了猪群中由链球菌引起的脑膜炎、关节炎和败血症。猪链球菌亦可引起人类感染,尤其是屠宰场工人及与猪和猪肉产品接触密切者。猪链球菌2型感染人的最早病例报道于1968年丹麦,传染源为病猪及其猪肉。人感染猪链球菌病的主要临床表现是细菌性脑膜炎、关节炎、败血症、心内膜炎,眼内炎和永久性失聪等。中国分别于1998年和2005年出现了两次人感染猪链球菌病的暴发流行,不仅造成大量猪只死亡,而且两次感染流行均有致人死亡的记录,2005年流行引起的致死人数多达数十人。与国外不同的是,我国1998年与2005年猪链球菌的重症感染死亡病例多表现为链球菌中毒性休克综合征(STSS)。迄今为止,对猪链球菌致病机理的理解还非常有限,基本得到确认的猪链球菌毒力因子也只有荚膜多糖(CPS)、胞外因子(EF)、溶菌酶释放蛋白(MRP)和猪溶素(SLY)等几个。至于猪链球菌如何与宿主机体互动,各毒力因子的作用机理及各因子之间相互作用的关系尚不很清楚。在近年我国面临猪链球菌感染暴发流行威胁加重的形势下,对该菌毒力因子和细菌本身致病机理的研究已成为当务之急。方法:依据已知的SLY核苷酸序列,克隆表达SLY蛋白。表达产物经过Ni柱亲和层析纯化,并在纯化完成后进行梯度复性。采用饱和硫酸铵沉淀和阴离子层析、疏水层析相结合的方案,从2型猪链球菌的培养物中提取天然表达的SLY蛋白。完成复性的重组蛋白和纯化的天然蛋白用免疫印迹法、溶血活性和特征实验等方法鉴定了其性质,并利用纯化的包涵体蛋白制备了SLY蛋白的多克隆抗体。利用ELISA、Western blot和溶血活性等多种方法,比较了猪链球菌中国流行株和非流行株SLY产量的差别,并通过建立体外细胞模型、体内动物感染模型比较了流行株与非流行株对细胞和动物毒性差异,初步探讨了SLY的作用机理。结果:本实验成功提取出电泳纯的天然SLY蛋白,纯化的蛋白通过对其溶血活性和溶血特征的判定,证明该蛋白正是猪链球菌溶血素SLY蛋白。sly基因成功地克隆到pET28a载体中,以包涵体形式表达,通过梯度复性,获得的复性蛋白具有较好的溶血活性,溶血特征与文献报道一致。分别通过免疫新西兰大白兔和Wistar大鼠得到两种抗SLY多克隆抗血清,并用蛋白A亲和层析柱完成了多克隆抗体的纯化。对多株猪链球菌中国流行株和非流行株培养上清的SLY蛋白浓度进行定量和半定量观察发现,流行株增强了其SLY的表达,其培养上清表现出更强的溶血活性,而流行株与非流行株的生长速度并无区别。体外实验和体内实验证明,SLY表达增强的流行株对细胞毒性增强,SLY蛋白有利于菌血症的形成,对动物组织有直接的损伤作用,并可在体外抑制中性粒细胞对猪链球菌的吞噬活性。结论:1、本研究采用硫酸铵沉淀,结合阴离子层析和疏水层析的方法提取猪链球菌溶血素SLY蛋白,该方法简便易行,适宜进行较大规模的蛋白提取。通过此纯化路径可以得到纯度较高的天然SLY蛋白,并且具有良好的生物活性,适合进行下一步生物活性的研究。2、将sly基因克隆至pET28a载体,诱导表达的SLY蛋白为包涵体形式,包涵体蛋白具有良好的抗原性,通过免疫动物可以得到滴度较高,特异性较好的多克隆抗体;通过梯度复性的SLY包涵体蛋白,溶解度较低,但生物活性良好。3、通过对比猪链球菌中国流行株与非流行株培养物上清的溶血活性,以及对上清中SLY蛋白含量进行定量,结合相关研究的基因芯片数据和qRT-PCR数据,我们认为在猪链球菌流行株中,SLY蛋白表达增强,这一表型的变化可能与猪链球菌基因型上的变化有关,具体的调控机理有待进一步挖掘。4、我们设计了一系列的动物模型和细胞模型以研究溶血素的生理功能的和溶血素SLY表达增强对细菌毒力和致病性产生的影响,所得到的结果提示溶血素表达增强有利于细菌穿透宿主屏障系统,逃避固有免疫系统攻击,导致猪链球菌流行株表现出对细胞和动物更强的毒性,在宿主体内更强的存活能力,所以我们认为增强表达的猪链球菌溶血素可能与该菌在中国地区的暴发流行有关。