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酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是人类文明史中最重要的微生物,被广泛应用在面包和酒精发酵领域。该种还是最重要的真核生物研究模型,是最被广泛和深入研究的分子生物学和细胞生物学模型,并正在成为真核微生物生态学、群体遗传学和物种分化的研究模型。但该种在自然环境中的生态分布和群体结构尚未被充分认识。 本文主要对酿酒酵母遗传多样性和群体演化进行了研究,对67株国内野生来源的酿酒酵母的四个蛋白基因进行测序,并将其串联构建系统发育树,揭示我国境内不同自然环境来源的酿酒酵母群体演化规律;对来源于不同生态环境的112株酿酒酵母作了耐香草醛,耐乙酸,耐酒精和耐高温等与纤维素生产燃料酒精工业应用相结合的研究分析;还对不同来源和亲缘关系比较远的菌株进行杂交后代的定向选育,探索了运用定向群体演化的方法选育有工业应用潜力菌株的可行性,主要研究结果如下: 1.对来源于海南和福建的160份腐木样品分别在葡萄糖和木糖作唯一碳源的培养基中进行了富集分离,共得到489株酵母,共51个种,分属于20个属,其中酿酒酵母13株,还发现了2个新种。对能发酵木糖的酵母Pichia stipitis和Candida shehatae进行了发酵玉米秸秆裂解液生产酒精的测试。结果显示这些菌株在没有抑制物存在的营养丰富的木糖培养液中,发酵木糖产生酒精的效率高达83%。然而,在含有抑制物的玉米秸秆裂解液中,发酵木糖生产酒精的能力变得很差。通过调整裂解液的pH值到7-9,显著提高了酒精发酵效率。为纤维素酒精工业,提供了值得借鉴的解决方案。 2.对国内各种自然环境中来源的67株酿酒酵母的四个功能基因片段CDC19,PHD1,FZF1和SSU1进行测序,并且与国外菌株序列比较分析,对单基因序列的多态性进行比较和分析。并且将四个基因序列串联构建了N-J系统发育树,对酿酒酵母的群体演化进行了研究分析。结果显示这些菌株之间存在很高的遗传多样性,生态环境相似的菌株,具有相似基因序列,说明生态环境比地理位置对群体演化做出的贡献大。四个蛋白基因串联序列分析,支持国内酿酒酵母存在独特的树皮和腐木来源的种群,形成与水果或者其它来源的酿酒酵母相对较远的亲缘关系。 3.建立了以96孔板为平台的高通量评价酵母抗逆性的方法。对112株来源于不同生态环境的野生酿酒酵母进行了纤维素燃料酒精工业应用相关的抗逆性能的评价,包括对耐酒精,耐高温和耐抑制物等的评价分析。发现从酵面中分离到的酿酒酵母具有更加耐受高酒精浓度和更加耐受高温的特点,与其它来源的菌株在这些方面具有显著的差异;而来自树皮和腐木的菌株则更加耐受抑制物香草醛。这一现象表明不同酵母的特点与生态环境有直接的关系。这些评价结果,将作为进一步杂交选育优良特征酵母的基础和依据。 4.基于群体分化和抗逆性评价试验结果,选择抗逆性较强且产孢率较高的酿酒酵母菌株,进行群体远源杂交,对杂交后代在不同温度和酒精浓度等环境压力下进行选育,得到了比出发菌株更耐酒精的后代,传代试验证明其耐酒精性状比较稳定。