目的:　　1.建立灵敏度高、专属性强、方便可行的HPLC-QTOF-MS/MS法测定Wistar大鼠生物样本中的岩白菜素及岩白菜素代谢产物。　　2.获得岩白菜素标准品的准分子离子峰，二级碎片离子，推测其二级碎片裂解方式。　　3.测定灌胃给予岩白菜素混悬液后大鼠生物样本中的代谢产物。　　4.根据测得的岩白菜素代谢产物结构推测岩白菜素在大鼠体内的代谢途径。　　5.确定岩白菜素在混合HLMs孵育体系中的最佳混合HLMs浓度和最佳孵育时间。　　6.建立灵敏度高、稳定性好、方便可行的HPLC-MS/MS法、HPLC法测定岩白菜素的葡糖醛酸化代谢产物。　　7.研究β-D-葡萄糖醛酸苷酶对葡糖醛酸化岩白菜素的水解作用。　　8.考察岩白菜素在UGT重组酶孵育体系中的葡糖醛酸化反应。　　9.测定岩白菜素葡糖醛酸化的酶动力学参数。　　10.考察13个个体的HLMs中岩白菜素和胆红素葡糖醛酸转移酶活性的相关性分析。11.考察UGT1A1重组酶抑制剂保泰松、底物雌二醇和胆红素对岩白菜素葡糖醛酸化反应的抑制作用。　　方法:　　1.Agilent6538 HPLC-QTOF-MS/MS仪器进行样本分析，流动相A为水，流动相B为乙腈，流动相比例为5％-95％B(0-20 min)，95％B(20-22 min)，95％-5％(22-25 min)，流速:0.8 mL/min，进样量10μL，每个样本进样完成后平衡10 min。　　2.配制500 ng/mL岩白菜素标准溶液进行HPLC-QTOF-MS/MS全扫描和子离子扫描(MS2)分析。　　3.分别采集灌胃给药前和给药后Wistar大鼠生物样本，对样本沉淀蛋白处理后，进样HPLC-QTOF-MS/MS系统进行全扫描分析，对比给药前与给药后生物样本总离子色谱图提取的准分子离子，对可能的代谢产物进行二级碎片扫描(MS2)分析，根据特征性二级碎片确定岩白菜素代谢产物的结构。　　4.根据岩白菜素及代谢产物的结构推测岩白菜素在Wistar大鼠体内代谢途径。　　5.岩白菜素分别在0.25、0.5、0.8、1.0、1.25 mg/mL混合HLMs孵育体系中孵育30 min后终止反应考察混合HLMs最佳孵育浓度。0.8 mg/mL混合HLMs孵育体系分别在孵育0、10、20、30、40、50、60、70、80 min后终止反应，考察孵育体系的最佳孵育时间。　　6.岩白菜素分别与含有UDPGA的有活性或高温灭活后的混合HLMs孵育体系进行孵育，采用HPLC-MS/MS方法对岩白菜素葡糖醛酸结合产物进行定性分析。Diamonsil C18色谱柱(150×4.6 mm，5μm);流动相为甲醇∶0.1％甲酸水=30∶70(V/V)，在线脱气;流速0.4 mL/min;柱温30℃;进样量10μL，ESI离子源，分别采用正、负离子模式对样本进行分析，采用全扫描(scan)、选择离子检测(SIM)及子离子扫描(Product Ion Scanning)模式对样本进行分析。采用HPLC-UV方法对岩白菜素葡糖醛酸结合产物进行定量分析，Diamonsil C18色谱柱(150×4.6 mm，5μm);流动相为甲醇∶0.1％甲酸水=15∶85(V/V);流速1 mL/min;柱温室温;监测波长272 nm;进样量20μL。　　7.多个岩白菜素标准溶液样本在混合HLMs孵育体系中孵育30 min加入终止液终止反应，收集、混合所有样本的上清液，并分为两组实验组和对照组，每组重复3个样本，所有样本40℃水浴N2吹干后，实验组采用500μL含2000单位β-D-葡萄糖醛酸苷酶的0.05M醋酸钠缓冲液复溶，对照组采用500μL不含β-D-葡萄糖醛酸苷酶的0.05 M醋酸钠缓冲液复溶。复溶样本37℃水浴中孵育4h后取出100μL用终止液中终止反应， HPLC-MS/MS系统进样分析。　　8.采用50，250，500μM岩白菜素标准溶液分别与灭活的或未灭活的不同UGT重组酶进行孵育。　　9.岩白菜素系列浓度分别在混合HLMs和UGT1A1重组酶进行孵育，测定葡糖醛酸化岩白菜素的浓度，拟合酶动力学曲线，并根据米氏公式计算酶动力学参数Km值、Vmax、 CLint(Vmax/Km)。　　10.250μM岩白菜素标准溶液和100μM胆红素标准溶液分别与13个不同个体的HLM进行孵育，分别测定葡糖醛酸化岩白菜素和葡糖醛酸化胆红素的浓度，计算其代谢速率。由葡糖醛酸化岩白菜素代谢速率对葡糖醛酸化胆红素代谢速率做直线分析，所得相关系数(r)评价两药相关性，P＜0.05认为有显著性差异。　　11.250μM岩白菜素标准溶液分别与有活性混合HLMs或UGT1A1重组酶孵育体系进行孵育作为阳性对照组，与高温灭活的混合HLMs或UGT1A1重组酶孵育体系进行孵育作为阴性对照组，实验组分别采用250μM岩白菜素与10-500μM保泰松、雌二醇、胆红素与有活性混合HLMs或UGT1A1重组酶孵育体系共同孵育。采用HPLC法分别测定阴性对照组，阳性对照组及各实验组的素葡糖醛酸化岩白菜的浓度，分别计算保泰松、雌二醇、胆红素对岩白菜素的IC50。　　结果:　　1.HPLC-QTOF-MS/MS法测定Wistar大鼠生物样本中的岩白菜素及岩白菜素代谢产物灵敏度高、专属性强、方便可行。　　2.进样分析岩白菜素标准溶液，岩白菜素的准分子离子[M-H]-为m/z327.0718。m/z327.0718的主要二级碎片离子为m/z312.0491，249.0407，234.0169，207.0295，192.0061。　　3.对灌胃给药前后的大鼠生物样本总离子流色谱图进行提取离子分析，对比给药前和给药后生物样本中的准分子离子，找出了几种可能的代谢产物，并根据其MS2信息进一步推测代谢产物的结构，结果显示在胆汁、尿液及粪便样本中发现了岩白菜素(M0)(m/z327.07)及其代谢产物M1和M1(m/z503.11)，M2和M2(m/z407.03)和M3(m/z359.10)，在血浆样本中发现了岩白菜素(M0)(m/z327.07)及其一种代谢产物M3(m/z359.10)。　　4.根据岩白菜素代谢产物结构推断岩白菜素在大鼠体内的代谢途径为葡糖醛酸化、硫酸化、水解合并甲基化三种途径。　　5.岩白菜素在不同浓度(0.25、0.5、0.8、1.0、1.25 mg/mL)混合HLMs孵育体系中孵育30min后，结果显示0.8 mg/mL混合HLMs孵育体系中岩白菜素的代谢率在25％左右;岩白菜素在0.8 mg/mL混合HLMs孵育体系中分别孵育0、10、20、30、40、50、60、70、80 min后终止反应，结果显示孵育30 min时岩白菜素浓度的代谢率在25％左右，最终确定岩白菜素孵育体系的混合HLMs最佳孵育浓度为0.8 mg/mL，最佳孵育时间为30min。　　6.岩白菜素分别与含有UGDPA的有活性或高温灭活后混合HLMs孵育系统孵育后，HPLC-MS/MS法对样本进行定性分析，对比两组样本的质谱图结果发现有活性的混合HLMs孵育组有准分子离子峰m/z503.1([M-H]-)，与岩白菜素的准分子离子峰m/z327.1相差176 Da，且其二级碎片中含有葡糖醛酸基团的特征性碎片m/z175和112.9，最终确定该代谢产物为葡糖醛酸化岩白菜素。HPLC法对葡糖醛酸化岩白菜素的定量分析重现性好、精密度高，稳定性好，与杂质分离完全，适用于酶动力学参数的测定。　　7.经β-D-葡萄糖醛酸苷酶水解的代谢样本中，葡糖醛酸化岩白菜素消失，岩白菜素原形药的增加与减少的葡糖醛酸化岩白菜素一致，未添加β-葡萄糖醛酸苷酶的对照组中葡糖醛酸化岩白菜素及岩白菜素原形药未见变化。　　8.50、250、500μM的岩白菜素分别与不同的UGT重组酶(UGT1A1、1A3、1A4、1A6、1A7、1A8、1A9、1A10、2B4、2B7、2B15、2B17)孵育后，结果显示只有UGT1A1重组酶中发生了代谢，产生岩白菜素葡糖醛酸结合产物。　　9.5μM-1 mM岩白菜素经混合HLMs及UGT1A1重组酶孵育体系孵育后所得葡糖醛酸化岩白菜素的酶动力学参数Km值、Vmax、 CLint(Vmax/Km)结果分别为231.62±14.08和200.37±26.73μM，2.17±0.21和1.88±0.26 nmol/min/(mgprotein)，9.39和9.38μL/min/(mg protein)。　　10.岩白菜素葡糖醛酸活性与重组人UGT1A1探针底物胆红素葡糖醛酸活性具有显著相关性(R2=0.9629，P＜0.01)。　　11.在混合HLMs和UGT1A1重组酶孵育体系中UGT1A1重组酶的抑制剂保泰松，底物雌二醇和胆红素对250μM岩白菜素的IC50分别为92.89±6.3和77.3±7.3，112.98±12.4和97.27±15.6,68.55±8.2和59.57±11.7μM。　　结论:　　1.本研究利用HPLC-QTOF-MS/MS技术分析灌胃给药岩白菜素前和给药后大鼠的胆汁、血浆、尿液和粪便样本，分析可能的代谢产物，利用二级碎片推测其结构特征。结果发现大鼠胆汁、血浆、尿液、粪便样本中共存在岩白菜素3种可能的代谢产物(M1和M1 m/z503.11，M2和M2 m/z407.03，M3 m/z359.10)，分别为葡糖醛酸化、硫酸化、水解合并甲基化三种代谢途径。　　2.岩白菜素的体外代谢研究发现，在UDPGA存在的混合HLMs孵育体系中岩白菜素发生葡糖醛酸化反应，UGT1A1重组酶为岩白菜素葡糖醛酸化的主要代谢酶。UGT1A1重组酶的抑制剂保泰松，底物雌二醇和胆红素均对混合HLMs和UGT1A1重组酶孵育体系中岩白菜的素葡糖醛酸化有抑制作用。UGT1A1特异性底物胆红素葡糖醛酸代谢和岩白菜素的葡糖醛酸代谢相关性极高。