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脊椎动物脑在进化过程中发生了巨大的变化。这些变化主要发生在前脑当中,尤以新皮层的进化最为明显。这些进化的机制还不清楚。有研究显示脑表达调控基因的进化很有可能与脑区进化相关。本文选择了8个脊椎动物脑表达,并对表达脑区的早期发育形成有重要作用的同源框基因及T-Box基因作为研究对象:主要在新皮层表达的基因Emx1、Emx2,全皮层表达的基因Tbr1、皮层下表达的Pax6,纹状体表达基因Dlx2,苍白球表达基因Nkx2.1,在中脑表达的基因Otx1,Otx2。对各脊椎动物世系六个代表物种的这八个基因进行对齐及绘制邻接进化树、比较进化速率,以及比较基本转录调控元件Motif种类数目。以期发现控制早期新皮层发育形成的基因进化与控制脊椎动物端脑其它部分基因及控制中脑后脑发育形成的基因进化有无差异。
我们首先通过数据库检索获得以下物种各基因编码区(CDS)序列:人(Homo sapiens),倭黑猩猩(Pan trogloclytes),小鼠(Mus musculus),红原鸡(Gallus gallus),非洲爪蟾(Xenopustropicalis),斑马鱼(Danio rerio),并统计分析了各基因在染色体上的分布和数目。使用ClustalⅩ2.0程序对各基因编码序列进行比对,将结果利用MEGA4软件包构建系统发育树,使用整合在MEGA中的Pamilo-Bianchi-Li法计算所获得脊椎动物的端脑及端脑下表达各同源框基因成熟蛋白编码区的每非同义位点的非同义替代数Ka,每同义位点的同义替代数Ks,得到Ka/Ks(即序列进化速率),进行Z检验和Fisher’s Exact Test检测各基因在进化中所受选择。我们发现这8个基因,各分类单元间序列Ka/Ks值都小于1；在进行Z-test后发现,它们在各分类单元间基本经历的都是净化作用,进化速率很慢,十分保守。说明脊椎动物端脑进化很可能不是因为这些基因受到正选择作用发生的变化引起的。使用Primer Premier5.0对人、小鼠、红原鸡、斑马鱼所选基因启动密码子ATG之前2000bp进行转录调控元件Motif分析,检测已知Motif序列的种类和数量。发现所选择序列范围内,只有鸡Emx1基因与其它物种Emx1基因相比,基本顺式作用原件和启动子数量较少,而其它所选物种所分析的基因基本顺式作用原件和启动子种类数目都不存在显著差异。推测所选基因的转录调控元件Motif的种类数目在分类单元间的变化与所表达位置的进化可能不存在关系。
但是,所选基因对齐后,发现与其他基因几乎严格保守不同,非哺乳类脊椎动物Emx1基因与哺乳类脊椎动物Emx1基因CDS序列相比,都缺失长达51bp的一段。哺乳动物Emx2基因编码蛋白与非哺乳动物相比,具有一段6-8个氨基酸残基的多聚丙氨酸序列。为了验证哺乳类多出这一段Emx1序列对新皮层的产生进化有没有作用,我们克隆了大鼠Emx1ORF全长,连接到真核表达载体pcDNA3上,构建pcDNA3-mEmx1真核表达质粒。通过胚胎电转染将pcDNA3-mEmx1混合pEGFP质粒转入E6鸡胚脑中,鸡脑随后切为600微米薄片加入Brdu体外培养两天,去掉Brdu继续培养两天。切片观察绿色荧光蛋白表达。后续进行Brdu免疫组化研究转入大鼠Emx1基因后,鸡脑新生细胞迁移的改变。