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皱纹盘鲍是一种名贵的海洋经济贝类,伴随其养殖规模的扩大,出现了病害频发和种质退化等问题,制约着产业的进一步发展。通过研究免疫相关基因表达规律,探讨皱纹盘鲍免疫机制,可为提高皱纹盘鲍抗病力提供理论参考。实时荧光定量PCR技术作为一种常用的分子生物学手段,可以快速、准确和灵敏的检测免疫相关基因的表达规律,从而了解其表达量的变化,进而探讨其功能。但是,基因表达量的分析需要稳定的内参基因进行校对,所以内参基因的选择决定着实时荧光定量PCR结果的准确性。本研究选取了皱纹盘鲍β-肌动蛋白(ACT)、18S核糖体RNA(18S)、细胞色素b(CYTB)、延伸因子1(EF1)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、核糖体蛋白S9(S9)和微管蛋白(TUB)等7个候选基因,以实时荧光定量PCR测定了各候选基因在皱纹盘鲍不同组织、不同发育时期以及受到藤黄微球菌和鳗弧菌刺激后血细胞样品中的Ct值,利用Bestkeeper、Normfinder和Genorm等内参筛选程序分析了各基因表达的稳定性;并以筛选出来的稳定基因为内参基因,检测了皱纹盘鲍C型凝集素分别在皱纹盘鲍各组织、各发育时期以及细菌刺激后血细胞中的表达规律。以内参筛选程序分析了各候选基因在皱纹盘鲍鳃、外套膜、性腺、血细胞、肌肉和肝脏等不同组织样品中的Ct值,通过Genorm和Normfinder分别分析M值和稳定值发现各候选基因稳定性由高到低为:ACT>CYTB>18S>TUB>EF1>GAP>S9;Bestkeeper分析标准差显示各候选基因稳定性由高到低为:CYTB>18S>TUB>ACT>EF1>GAP>S9。综合三种程序稳定性排序可以得出:检测某个基因在皱纹盘鲍不同组织样品中的表达时,CYTB可作为内参基因。通过实时荧光定量PCR技术获得皱纹盘鲍2细胞、4细胞、8细胞、16细胞、桑葚期、原肠期,担轮幼虫、面盘幼虫、匍匐幼虫和稚鲍等不同发育时期的各候选基因的Ct值,经Genorm和Normfinder分析显示各候选基因的稳定性为ACT>CYTB>TUB>GAP>18S>EF1>S9;Bestkeeper分析显示各候选基因稳定性为TUB>ACT>GAP>18S>CYTB>S9>EF1。由三种程序综合分析后得出:检测某个基因在皱纹盘鲍不同发育时期样品中的表达时,ACT可作为内参基因。以Genorm、Normfinder和Bestkeeper分析了各候选基因在皱纹盘鲍受到不同细菌刺激后血细胞样品中的Ct值。①藤黄微球菌刺激后,Genorm和Normfinder分析得出各候选基因稳定性由高到低为ACT>CYTB>TUB>EF1>18S>GAP>S9;Bestkeeper分析得出各候选基因稳定性由高到低为TUB>CYTB>ACT>EF1>18S>GAP>S9。②鳗弧菌刺激后Genorm分析得出各候选基因的稳定性为ACT>CYTB>TUB>EF1>18S>GAP>S9,Normfinder分析得出各候选基因的稳定性为ACT>CYTB>TUB>EF1>GAP>18S>S9,Bestkeeper分析得出各候选基因的稳定性为ACT>TUB>CYTB>EF1>18S>S9>GAP。综合三种程序的分析结果,在测定某个基因在鳗弧菌或藤黄微球菌后皱纹盘鲍血细胞样品中表达量时,ACT可作为内参基因。利用筛选出来的ACT和CYTB作为内参基因检测了C型凝集素基因在皱纹盘鲍不同组织、发育时期以及受到藤黄微球菌和鳗弧菌刺激后血细胞样品中的表达规律,结果表明:C型凝集素在不同组织中均有表达,在肌肉和血细胞中表达量最高;在桑葚期明显上升,至匍匐幼虫期达到最高并趋于稳定,可能与血细胞的形成有关;鳗弧菌或藤黄微球菌刺激后皱纹盘鲍后血细胞中C型凝集素表达量都有上升,暗示其可能参与机体抵御微生物的免疫应答。综上所述,相对于其他候选基因,ACT和CYTB基因表现出较好的稳定性,可作为内参基因用来检测某个基因在皱纹盘鲍不同组织、不同发育时期以及受到藤黄微球菌和鳗弧菌刺激后血细胞样品的表达规律。